细胞培养技术.ppt

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1、细胞培养基础知识覃兆鲜细胞培养理论部分内容1、细胞培养概念：细胞培养是指用机械法或酶消化法从组织中分离出细胞，并摹拟体内环境，在无菌、适当温度、酸碱度和营养条件下，使其生长增殖，并维持其正常结构和功能的一种培养技术.2、细胞培养原理：细胞培养原理简单的来说，就是在体外营造一个同机体内细胞生存环境相似的人工环境，从而可以使细胞在体外生存、生长、增殖3、体内、外细胞的差异体内细胞：机体神经体液调节和其他类型细胞影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减

2、弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱形态和功能趋于单一一定代数后衰老死亡，或发生转化，获不死性而成为能无限传代4、体外培养细胞类型贴壁依赖性细胞贴附于玻璃、或塑料等无活性物质的表面生长、生存和维持。悬浮培养细胞细胞悬浮于液体培养基中增殖。5、细胞周期细胞周期：细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程.G0期：细胞不再沿周期进行，进入休眠状态，G1期，----------DNA复制前期，主要进行RNA合成和蛋白质合成，为染色体复制做准备,S期-----------DNA复制期，完成DNA复制,G2期-

3、---------DNA复制后期，为纺锤丝的形成做准备,M期:有丝分裂期。群体中多数细胞处于间期，少数处于分裂期。分裂期较短。整个细胞周期可划分为G1→S→G2→M→G1，如下图所示：细胞生长曲线体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经过以下三个阶段：细胞生长曲线图:可用MTT法测定。用BRDU检测有丝分裂的细胞。BRDU（５－溴２

4、－脱氧尿嘧啶核苷)与胸腺嘧啶结构相似，在DNA合成过程中与胸腺嘧啶一样能掺入细胞DNA中，用BRDU单克隆抗体免疫细胞化学法可检测BRDU标记的结果，可直接观察DNA的合成过程，从而能客观地评价培养细胞的增殖分化情况，同时能避免对细胞的放射性损害。细胞调亡细胞凋亡是细胞自身程序结束,生命主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的自主有序的,有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。细胞凋亡特征凋亡发生的过程表现（细胞缩小→致密染色质边集→核碎片→凋亡小体）1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来2、细胞缩小：

5、①胞浆细胞器集中②胞膜出芽或起泡③细胞皱缩；3、保持胞浆细胞器完整性扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，①线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网（SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞表面平行的微丝束。4、形成调亡小体由凋亡细胞裂解为若干个由质膜包绕的小体，每个凋亡小体有自己的一簇细胞器。周围不引起炎症反应。5、核内染色质结构改变（这是最引人注意的改变）染色质凝集于核膜下表现为：①核质固缩；②边集；③核浆紧实；④核膜皱折。AnnexinV是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜

6、的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一，在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧，AnnexinV与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。细胞体外培养的影响因素血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。渗透压：培养液渗透压一般介于260~320mosm/kg之间培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可

7、根据培养需求合理选择贴壁和铺展因子，如某些细胞培养初不易贴壁,可以预先用0.1%明胶或多聚赖氨酸包被瓶皿.细胞培养基本过程取材无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的而定），经过一定的处理（如消毒、消化分散等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后应尽快培养，因故不能马上培养时，置4℃的培养液中保存，但时间不能超过24h。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染，可用500～1000单位/ml青