实验十 枯草杆菌蛋白酶活力测定xin.ppt

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1、枯草杆菌蛋白酶活力的测定生物化学实验之十安徽师范大学生科院生化教研室一.实验目的蛋白酶浸提、分离、提取技术最适条件下酶促水解反应的操作程序酶活力的测定及活力单位的计算二.实验原理比色测定酪蛋白蛋白酶酪氨酸钼蓝钨蓝酪氨酸Folin-酚试剂pH值、温度OH-三.实验试剂和器材试剂1.酚试剂；2.0.55M碳酸钠；3.10%三氯乙酸；4.0.5%酪蛋白；5.0.02MPH7.5磷酸缓冲液；6.50μg/ml酪氨酸；7.酶液。器材：7200型分光光度计；试管；水浴锅；坐标纸等。测定酶活的程序1、将酶液稀释到一定程度2、最适条件下进行酶促水解反应3、

2、测定反应量4、根据酶活单位定义计算酶活力【重点掌握】1、将酶液稀释到一定程度在底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，必须调整酶的最适稀释倍数即吸光度限制在0.25～0.40范围内。2、最适条件下进行酶促水解反应最适温度—37℃恒温水浴最适pH值—pH7.5缓冲溶液底物浓度足够大—1%酪蛋白溶液1mL反应时间准确—10min及时灭活—三氯乙酸2mL【重点掌握】3、测定反应量测定产物的增加量或底物的减少量—测定酪氨酸的生成量4、根据酶活单位定义计算酶活力酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。【重

3、点掌握】用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与Folin-酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液，680nm波长处，作出酪氨酸浓度-吸光度标准曲线。用酶促水解液进行同样操作，比色后，查阅标准曲线，即可求得待测酶活力。四.操作步骤（一）标准曲线的绘制1、取6支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；2、混匀器充分混匀后，置37℃恒温水浴反应20min；3、以0#管做参比，分别比色测定各管A680；4、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg）即为K值。项目管号012345标准酪氨酸溶液（ml）00.20.40.60.8

4、1.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20Na2CO3溶液（ml）5.05.05.05.05.05.0酚试剂（ml）0.50.50.50.50.50.5处理摇匀置于30℃水浴保温15分钟，冷却后比色。吸光度（680）表格(二)待测酶液的制备称取酶粉0.500g，用少量pH7.5缓冲液溶解……用缓冲液定容至50mL容量瓶中（N=100倍）。摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（至吸光度在0.25～0.40范围内，N=1000倍）。取3支试管，分别加入1mL酶液，置37℃预热5min空白管①平行管

5、②③2mL三氯乙酸37℃，10min2mL三氯乙酸37℃，10min1mL1%酪蛋白37℃，10min1mL1%酪蛋白37℃，10min过滤（1）（2）（3）(三)蛋白酶活力的测定另取3支试管，分别取①②③管滤液1mL（4）各加入5mLNa2CO3溶液、1mLFolin－酚试剂（5）37℃反应20min（6）（7）比色测定A680，①管做参比(四)酶活力的计算酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。蛋白酶活力（u/g或u/mL）=A×K×4×N10式中A—样品平行试验的平均吸光度；K—吸光常数；

6、4—反应试剂的总体积（mL）；10—反应时间10min，以1min计；N—稀释倍数所得结果表示至整数。五.结果与讨论常规酶活测定程序为：酶液适当稀释，最适条件下进行酶促反应，测定反应量，根据酶活单位定义计算酶活力。上述过程中，那个阶段的操作误差给实验结果造成的影响最大？如何防止？【思考题】