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时间:2018-07-06
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1、实验七枯草杆菌蛋白酶活力的测定学时数:4学时一、目的:学习测定蛋白酶活力的方法,掌握72型分光光度计的原理和使用方法二、原理:酚试剂又名Folin试剂,是磷钨酸和磷钼酸的混合物,它在碱性条件下极不稳定,可被酚类化合物还原产生蓝色(钼蓝与钨蓝的混合物)。酪蛋白经蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与酚试剂反应,所生成的蓝色化合物可用分光光度计法测定。三、器材:试管、吸管、漏斗、恒温水浴、722型分光光度计等四、试剂:标准酪氨酸溶液(100ug/mL),碳酸钠溶液(0.55mol/L),酚试剂,酶液,10%的三氯乙酸五、步骤:1、绘制标准曲线取试管7支,编号,按下表加入试剂。 单位
2、:(mL)编号1234567标准酪氨酸溶液(100ug/mL)00.10.20.30.40.50.6蒸馏水10.90.80.70.60.50.4碳酸钠溶液(0.55mol/L)5555555酚试剂1111111摇匀,置30℃恒温水溶中显色15min。用分光光度计在A680min 处测定680nm的光吸引值。以光吸引值为纵坐标,以酪氨酸的浓度为横坐标,绘制标准曲线。2、酶活力测定取酶液1mL,在30℃预热5min,吸取0.5%酪蛋白溶液2mL置于试管中,在30℃水浴中预热5min后加入的酶液0.5mL,立即计时,反应8min后,由水浴取出,立即加入10%三氯乙酸溶液3
3、mL放置15min,用滤纸过滤。同时另作一对照管,即取酶液0.5mL先加入3mL10%的三氯乙酸溶液。摇匀,然后再加入0.5%酪蛋白溶液2mL,30℃保温8min,放置15min,过滤。取3支试管,编号,分别加入样品滤液、对照滤液和水各1mL,然后各加入0.55mol/L的碳酸钠溶5mL混匀后再各加入酚试剂1mL,立即混匀,在30℃显色15分钟。以加入的一管作空白,在680nm处测对照及样品的OD值。Na2CO3溶液酚试剂30℃放置15minA68011ml----5ml1ml2--1ml--5ml1ml3----1ml5ml1ml3、计算酶活1克枯草杆菌蛋白酶在30℃
4、,pH7.5的条件下所具有的活力单位为:(A样-A对).K.V/t.N六、结果:
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