枯草杆菌蛋白酶活力测定

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1、教学目的、要求（例如识记、理解、简单应用、综合应用等层次）：在了解酶反应的基本条件、比色法测定物质含量的基础上，将这些知识运用到本实验中。掌握定量测定蛋白酶的活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性质，以及本反应的环境条件。教学内容（包括基本内容、重点、难点）：一原理1，枯草杆菌蛋白酶是一种水解酶，它能将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。2，所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质，此物质蓝色的深浅与酪氨酸的含量成比3，用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算

2、枯草杆菌蛋白酶的活力。二，操作：标准曲线的制作。设定不同标准浓度的酪氨酸，与酚试剂反应，来衡量生成颜色的深浅与酪氨酸浓度的关系。标准酪氨酸的浓度为0μg/ml，10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml,60μg/ml等，反应温度是30℃，反应时间为15分钟，然后测定OD680nm根据浓度和OD680做出浓度曲线酶活力测定样品管，按照酶的反应条件配制反应试剂，让蛋白酶充分的作用，然后取生成物的滤液与酚试剂反应，测定OD680样品对照管，操作和样品管的操作大致一样，仅

3、仅是在酶反应前将酶用三氯乙酸处理空白对照管，将以上两种的滤液用蒸馏水代替，让它与酚试剂反应酶的活力的计算酶活力单位：在30℃、pH7.5条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为一个酶的活力单位。样品管含量，要减去样品对照管和空白管，然后再利用标准曲线，查出相应的酪氨酸的量根据酪氨酸的量，即可以计算出枯草杆菌蛋白酶活力重点：1，测定酶的活力2，不同类型对照的设置难点：1，蓝色物质与酶活力的关系2，几个类型的对照实验教学过程设计（要求阐明对教学基本内容的展开及教学方法与手段的应用、讨论、作业布置）：从酶

4、的性质、底物的性质以及反应条件出发，引出生成物——酪氨酸，然后酪氨酸与酚试剂反应可以生成蓝色物质，而蓝物质的深浅与酪氨酸含量成正比，所以可以用比色法测定酪氨酸的含量。再一次讲述比色法测定物质含量的原理以及注意事项。讲述不同类型的对照管的设置要求。引导学生谈论为什么要设置对照管以及它们对实验的影响。参考资料（含参考书、文献等）：王镜岩等，生物化学，高等教育出版社，2001李建武等，生物化学实验原理和方法，北京大学出版社，2002赵赣等，生物化学实验指导，江西和学技术出版社，2000（参考：）生物秀：一、

5、实验目的1.加深了解酶活力的概念。2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。因此通

6、过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。试剂1.Folin-酚试剂：在2L磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 .2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 .2H2O)25g，蒸馏水700mL，85

7、%磷酸50mL以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。2.0.2mol/L盐酸溶液3.0.04mol/L氢氧化钠溶液4.0.55mol/L碳酸钠溶液5.10%三氯乙酸溶液6.0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲

8、液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 .12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B液)。取A液84mL，B液16mL混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。7.标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取12.5mg以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L盐酸约30mL溶解后，蒸馏水定容至250mL。8.酪蛋白溶液(0.5%)：