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时间:2019-11-05
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1、实验二十六 植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验,掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,在有氧的条件下,能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度,即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下: 多酚氧化酶邻苯二酚(儿茶酚)+1∕2O2 ——————→邻醌+H2O 三、材料、仪器及试剂1.材料:马铃薯块茎等2.仪
2、器:UV-1206或UV-1240分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵或匀浆机;试管;移液管;纱布袋等。3.试剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP);0.01mol·L-1pH6.5磷酸缓冲液;0.1mmol·L-1pH6.5磷酸缓冲液;0.05mol·L-1pH5.5磷酸缓冲液;30%饱和度硫酸铵;0.1mol·L-1儿茶酚;20%三氯乙酸。四、实验步骤1.粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中,加入0.5g不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏水浸洗,然后过滤以除去杂质)和100ml0.1mol·L-1pH6.5磷酸缓冲液,磨
3、成匀浆,用几层纱布袋过滤,滤液加入30%饱和度硫酸铵,离心除沉淀,上清液再加硫酸铵使达60%饱和度,离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2~3ml0.01mol·L-1pH6.5磷酸缓冲液中,即为粗制酶液。2.活性酶的测定在试管中加入3.9ml0.05mol·L-1pH5.5磷酸缓冲液,1.0ml0.1mol·L-1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min,然后加入0.5ml酶液(可视酶活性增减用量),迅速摇匀,倒入比色杯内,于525nm波长处以时间扫描方式,在1~2min内测定吸光度变化(A)值。五、酶活性的计算以每mi
4、n内A525值变化0.01为1个酶活力单位,按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。 A酶提取液总量(ml) 酶活力(0.01A·min-1)=———————×——————————— 0.01×反应时间 测定时酶液用量(ml) A酶提取液总量(ml)酶的比活性(0.01A·g-1Fw·min)
5、=————————×—————————— 0.01×W×反应时间 测定时酶液用量(ml) 公式中:A—为反应时间内吸光度的变化值;W为样品鲜重(g)。
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