高效液相色谱分析技术—方法开发(陈桂良).ppt

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1、高效液相色谱分析技术—方法开发上海市食品药品检验所陈桂良方法开发方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的pKa或pKb值、溶质分子的极性和大小、紫外可见光谱性质、氧化还原行为、浓度范围、溶解度以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或定量要求。建立高效液相色谱分析方法的一般步骤通常在确

2、定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。分析物理化性质混合分析物的主要差异分子结构和特性●方法开发前要确定的基本问题1、分析物的物理、化学性质样品基质----决定前处理方法溶解性----决定正、反相方法酸碱性----确定色谱柱类型、流动相组成pKa----确定流动相的pH值化学结构、特征官能团、

3、Etc.●方法开发前要确定的基本问题2、混合分析物的主要差异疏水性差异----用疏水性选择性强的色谱柱极性差异----用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异----用芳香选择性色谱柱混合差异----用多种选择型色谱柱分子量差异----GPC、GFC●方法开发前要确定的基本问题3、分子结构决定选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.如何得到最理想的分析结果流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响峰保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好,但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果,可以改变下列的一项或数项条件:流动相固定相p

4、H温度如何选择适当的色谱柱理想的柱子可以适用于分析所有的化合物永远不会坏理想分离度决定峰分离度的三个要素峰保留时间选择性(出峰的顺序)柱效固定相的选择疏水性的选择极性的选择苯基的选择固定相疏水性考虑的要素键合相的种类(C18,C8,Phenyl,etc)表面积键合相的键合率色谱柱选择表颗粒直径及形状(球型及不规则型)柱长及柱内径表面积及孔径碳负荷及键合类型Luna™C18(2)GinsengRootColumn:Luna5µmC18/ODS(2)Dimensions:150x4.6mmIDElutionType:GradientEluentA:Acetonitrile/wa

5、ter(15:85)EluentB:Acetonitrile/water(80:20)FlowRate:1.5mL/minTemperature:25°CDetection:UV-VisAbs.–VariableWave.@205nmAppID1125Luna™C8(2)&C5减少疏水性化合物的保留时间减少分析的时间Synergi™Max-RP疏水性和C18柱类似–为一支C12柱提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合物Synergi™Max-RPBasicDrugsatNeutralpH疏水性的比较C18phasesC8phase300ÅC18phase极性选择性的考

6、虑首先考虑固定相的极性封尾,封端基团分析物的极性官能基之间的作用极性选择性如何增加极性的选择性极性基团封端极性基团镶嵌苯基极性选择性Columns:Luna™5mC18(2)YMC-Pack™5mProC18Synergi™4mPolar-RP®(Ether-linkedPhenyl)150x4.6mmMobilephase:75:25Methanol:waterFlowrate:1mL/minComponents:1.Estrone2.Estradiol极性选择性Luna™C18(2)Synergi™Polar-RP®YMC-Pack™ProC181+21+212S

7、ynergiMax-RP-C12SynergiHydro-RP-C18SynergiFusion-RP–C18SynergiPolar-RP–PhenylSynergi™SilicaAdvantageBalancingEfficiency&BackpressureLinearVelocity(mm/sec)PlateHeight(H)5µ4µ3µFlowRate(mL/min)PressureDrop(Bar)higherefficiencieslowerbackpressuresSynergi™Synergi™M