氨基酸的测定方法.pdf

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1、氨基酸的测定方法—茚三酮柱后衍生法北京市营养源研究所叶颖慧参考方法：GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定从各种生物体中发现的氨基酸有180多种，但参与蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸有二十二种。除脯氨酸外，这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相连的α-碳原子上都有一个氨基，因而称α-氨基酸。结构通式如下：1.适用范围本方法适用于食品中蛋白质水解得到的天冬氨酸、苏氨酸等十六种氨基酸的测定；不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食品中氨基酸测定。2.原理食物中的蛋白质经盐酸水解，成为游离氨基酸，再用氨基酸自动分析仪进行测定。氨基酸分析仪是应用离

2、子交换层析原理，离子交换柱树脂为磺酸型强阳性阳离子交换树脂。氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，用不同PH的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合物分开，一般是酸性和含羟基的氨基酸最先被洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。分离流出色谱柱的氨基酸在135℃下与茚三酮反应生成紫色物质茚二酮炔一茚二酮胺（DYDA），通过分光光度计测定其含量。其最低检出限为3pmol。（1）蛋白质水解原理蛋白质是由氨基酸通过肽键首尾相连而成的共价多肽链。一分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分子的氨基脱水而形成的酰胺叫做肽，其形成的酰胺键称为肽键。ROR'ROR'-H

3、2ONH2CHCOH+NH2CHCOOHNH2CHCNHCHCOOH肽键蛋白质水解就是使蛋白质逐渐降成分子量越来越小的肽段，破坏肽键，直到最后成为氨基酸的混合物。（2）氨基酸分离原理氨基酸是两性电解质，在水中既起酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用。氨基酸在溶液中的存在形式：氨基酸分离：（2）氨基酸与茚三酮反应原理3.试剂除注明外全部试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。（1）6mol/L（0.5%巯基乙酸）盐酸溶液：优级浓盐酸与水以体积1比1混合，加入巯基乙酸5mL混匀。（2）0.02mol/L的盐酸溶液：吸取1mL的6mol/L盐酸溶液，加入300mL的

4、蒸馏水，混匀即可。（3）BRIJ-35溶液：25g溶于100mL蒸馏水中。（4）缓冲溶液：（参考日立L-8900氨基酸自动分析仪）R○三菱化学公司生产的MCIL-8500系列缓冲溶液，或根据下表配制缓冲溶液名称PH-1PH-2PH-3PH-4PH-RG容器B1B2B3B4B6钠浓度N0.160.200.201.200.20密度1.021.021.021.061.001蒸馏水（约）mL7007007007007002柠檬酸钠（二水）g6.197.7413.3126.67—3氢氧化钠g————8.004氯化钠g5.667.073.7454.35—5柠檬酸（一水）g19.

5、8022.0012.806.10—6乙醇mL130.020.04.0—100.07苯甲醇mL———5.0—8硫代双乙醇mL5.05.05.0——9BRIJ-35溶液mL4.004.004.004.004.0010PH（标称）3.33.24.04.911总计（校准）L1.01.01.01.01.012辛酸mL0.10.10.10.10.1注：上表仅供参考。根据不同的仪器和不同的色谱柱，需要调整缓冲溶液的配方。（5）茚三酮溶液：日本和光纯药工业公司成套茚三酮试剂，或根据下表配制茚三酮试剂容器步骤试剂计量单位R1—茚三酮1乙二醇独甲醚979mL2茚三酮39g3氮气起泡，分

6、解5min4硼氢化钠81mg5氮气起泡30min密度0.96R2—茚三酮缓冲溶液1蒸馏水336mL2醋酸钠272g3冰醋酸123mL4乙二醇独甲醚401mL5总计1000mL6氮气起泡10min密度0.96R3—5%乙醇溶液1蒸馏水950mL2乙醇50mL3总计1000mL密度1.00（6）氮气（7）标准溶液配制购买的氨基酸原液（FlukaAAS18）中每种氨基酸的浓度为2.50μmol/mL。氨基酸标准液中吸取2mL，用0.02mol/L盐酸稀释定容至50mL。每20μL溶液中，每种氨基酸含量为2nmol，稀释后标准于冰箱中冷藏，保存期约1个月。也可根据下表配制标

7、准原液称样量定容体积分子量吸取体积稀释体积定量管上机浓度标准名称浓度mgmLmg/mLg/molmLmLulnmol/20ulASP33.282500.13312133.11550202.000THR29.772500.11908119.08550202.000SER26.272500.10508105.06550202.000GLU36.792500.14716147.14550202.000GLY18.772500.0750875.07550202.000ALA22.272500.0890889.06550202.000VAL29.282500.117121