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1、1.SupersciptII―RT 合成第一链 :1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’) 11-xul RNase-freewater（大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一链,第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链
2、合成.）2.混匀后,70℃反应10分钟;3.反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂: 4ul 5×firststrandbuffer2ul 0.1MDTT1ul 10mMdNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;6. 反应完成,趁热加入1ulSupersciptII―RT,混匀;7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶. 2.cDNA 第二链的合成 :
3、1.第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNAPolymeraseIbuffer6ul 10mMdNTP(自己配制)xul ddH2 O1ul RNaseH(2U/ul)10ul DNAPolymeraseI(10U/ul)总体系为200ul;2.混匀后,16℃反应2.5小时;3.70℃灭活10分钟;4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存
4、的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。3. 双链 cDNA 末端补平 :1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mMdNTP2ul T4DNAPolymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml)2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4.
5、离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。PCR纯化
6、试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB，混匀。3．加入spincolumn中，13000rpm离心1min。4．加入0.75mlbufferPE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spincolumn放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ulbufferEB，静置10min。9．13000rpm离心2min。1
7、0．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。4EcoRIadaptor 加接 :1.往双链cDNA沉淀中加入9ulEcoRIadaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,顺序加入下列试剂: 1.2ul 10×LigaseBuffer1ul 10mMrATP1ul T4DNALigase(4U/ul)3.混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接; 5 双链 cDNA 末端的磷酸化及 XhoI 酶
8、切 :1.连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4DNA Ligase;2.稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul 10×LigaseBuffer1ul 10mMrATP6ul ddH2 O1ul T4PNK(10U/ul)3.37℃反应30分钟,然后70℃灭活15
