常规反相分析方法开发的流程

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1、1.回顾样品信息样品的分子量、pka、酸碱性　流动相需要缓冲盐吗？酸性、碱性化合物需要加缓冲盐来控制流动相pH样品需要预处理吗？有损坏色谱柱的、干扰检测的成分则预处理2.明确分离目标足够的分离度、最短的分离时间、精确度等3.展开起始的分离色谱柱：100mm*4.6mm*3um，C18或者C8（或者其他大小和内径）流速：　2ml/min柱温：　30℃或35℃流动相：样品不含酸和碱：　乙腈和水流动相：样品含酸和碱：乙腈和（pH2.5-3.0）（10-25mmol/l）缓冲盐根据样品pka选择流动相的pH（流动相的pH在样品的pka±1.5的外）

2、，根据流动相pH选择缓冲液，尽量选择pka与流动相的pH相等的缓冲盐，浓度经常为5-50mmol/l。磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐都是在pH小于8时最常用的缓冲液。梯度：10分钟内5%~100%B3.1.遇到的问题：过早洗脱（说明样品的极性大，离子化的酸或碱）可以减少起始的%B或者使用起始梯度停留改变流动相的pH增强他们的保留（减少分子的离子化）在流动相中加入离子对试剂使用正相色谱或者HILIC过迟洗脱（样品的极性很小）使用亲酯性较弱的色谱柱（降低H值，见附件1）使用正相色谱复杂的样品（样品大于15种成分）如果都是目标化合物，可使用2D色谱几个化

3、合物是目标成分：样品先预处理4优化梯度色保留因子k起始的分离条件对于大多是小分子样品（分子量＜1000）一般能使k值大约为55.优化梯度选择性梯度时间和柱温是首选。建议第二个方法将梯度时间延长2-3倍，在没有分开的情况下可以进一步延长时间获证增加柱温为50℃5.1：加入步骤5的分离度＜2，或者需要增短时间用甲醇替代乙腈重复步骤1-4更换色谱柱重复步骤1-4考虑使用分段梯度6.调整梯度范围和形状A:考虑最佳的起始和最终的%B值，从而在分离度Rs合理的前提下实现最短的实验时间B:对于“较脏的”的样品，加入坡度较大的梯度分段至100%B（例如在5

4、min至100%B，维持3-5min等）C:加入坡度较大的梯度分段来加速色谱图后端的、间隔较宽的色谱图峰的洗脱D:加入的等度度停留从而改善梯度前洗脱出来的色谱峰之间的分离度7.以步骤5、6中获得的最佳的分离效果为基础，平衡分离度和运行时间改善色谱柱的条件色谱柱的大小、粒径、流速、样品的分子量运能影响色谱柱的塔板数。粒径和色谱柱的大小通常在方法建立之前已选好。增长色谱柱的长度通常能增加塔板数、分离度、实验时间。在梯度洗脱中，使tgF/L保持恒定，从而使保留因子K*保持恒定。保留因子K：tg:梯度时间；F：流速；Vm：死体积；ΔØ：梯度范围；S

5、：分子量在100-500Da的样品S值为4。8.测量连续的阳阳机那样之间，色谱柱的必要平衡时间以上面选好的实验条件开展连续几次同样的分离，并同时改变进样之间的平衡时间；选择能给出合理分离效果的的最短的平衡时间一般使用10个或者以上的色谱柱体积的其实流动相来平衡色谱柱（约等于10乘死时间的体积）附件1：