资源描述：
《运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、应用微生物技术实验设计班级:姓名:学号:运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株%1.实验目的1.学会从土壤中筛选到植酸酶菌株。2.掌握紫外诱变菌株的方法。3.学会从变异的菌株中筛选高产菌。%1.实验原理植酸(又称为肌醇六磷酸)在多种植物组织(特别是米糠与种子)中作为磷的主要储存形式，其结构是肌醇的6个超基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物。植酸以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内，也存在于动物有核红细胞内，可促进氧合血红蛋白中氧的释放，改善血红细胞功能，延长血红细胞的生存期。植酸本身就是对人体有益的营养品
2、，植酸在人体内水解产物为肌醇和磷脂，前者具有抗衰老作用，后者是人体细胞重要组成部分。植酸酶，是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。具有特殊的空间结构。植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。以微生物的自然变异作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10
3、-6^10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便II十分有效是UV,UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集屮在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是喀噪间形成胸腺喀噪二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株，利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸钱分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和sephadexG-100凝
4、胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。三•实验材料1•材料(1)筛选培养基：1%植酸钙，3%葡萄糖,200U/ml青霉素钠,0.5%NH4N03,0.05%KCl,0.003%,MnS04.4H20,0.05%MgS04.7H20,0.003%FeS04-7H20,1.5%琼脂，pH5.5。(2)液体发酵培养基：1.5%葡萄糖，0.3%蛋白淼，0.2%(NH4)2S04,0.05%MgS04•7H2O,0.05%KCl,0.003%MnS04・4H20,0.003%FeS04.7H2O,pH5.5。(3)查
5、氏合成培养基：硝酸钠2g,磷酸氢二钾lg,氯化钾0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁O.Olg,蔗糖30g,琼脂15〜20g,水1000讥，pH自然，121°C灭菌20mino(4)斜面培养基：0.05%MgS04-7H20,0.003%MnS04-7H20,0.003%FeS04•7H20,鉄皮汁100ml,1.5~2%琼脂,pH5.50(5)土壤：去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm-10cm的土壤。2•仪器水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉
6、、干燥箱、超净工作台、移液管等四•实验步骤1•流程上壤样品稀释液初筛测量各透明圈与菌落直径的大小保藏菌种复筛—>菌种鉴定测酶活保藏菌种I制备单葩子菌悬液紫外诱变平板初筛I摇床复筛I测酶活保藏菌种分离纯化2.方法(1)菌株的筛选：土壤样品稀释1X1CT5倍，涂布于筛选培养基上，30°C培养72h,挑取产生透明圈的菌株。对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛，在220r/min的转速下发酵培养，测其酶活。-[崔志芳，刘娜，季爱云.植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化[J].中国酿造.2010(07)](2)酶活的测
7、定:锐钳酸镀法略加改进后进行测定。取1ml粗酶液加入2ml植酸钠溶液并摇匀(对照加入2ml机钮终止液)，37°C保温反应30min,立即加入2ml飢笛终止液(对照加入2ml植酸钠溶液)，415nm测OD值，参照磷标准曲线计算酶活。酶活定义:按上述方法，在pH5.5的条件下，每分钟从0.0051mol的植酸钠溶液屮释放1umol无机磷所需的酶量为一个活力单位(U)。磷标准曲线制备原理：利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性ffl-a试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成
8、黄色的帆钳磷络合物，在415nm波长下测定磷的含量试管号123456标准磷溶液(ml)00.40.81.21.62无机磷浓度(mmol/1)0246810去离子水(ml)21.61.20.80.40乍凡钳终止液2222220D值按表加入试剂后，在415nm波长下测0D值，并绘制标准曲线。-[杨平平，王燕，史宝军，陶文沂.对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨[1]・食品与发酵工业.2003(09)](3)菌种鉴定：将复筛酶活力最高的菌接种于查
