BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定

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1、BMPsII型突变受体真核表达载体的构建与鉴定【关键词】BMPsII型突变受体关键词：BMPsII型突变受体;真核表达载休0引言骨形成蛋白(BMPs)不仅在骨，软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用，而且起着十分重耍的调控作用[1]•与其他TGF-P超家族成员一样，BMPs在细胞表面与BMP的I,II型受体相互作用，I型受体可以和过量的配体结合，而II型受体与配体的结合则是特异性的[2].tBRK3k为BMPsII型突变受体，其可以阻断BMP的信号转导，这样,BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育，器官形成及细胞分化中的作用.因此，为研究BMPs信号转导

2、在组织发育和细胞分化中的作用，我们构建了BMPsI型突变受体的真核表达载体，为此方面研究的开展奠定了基砒1材料和方法1.1材料pSP64TL-tBRK3k质粒为含有BMPsII型突变受体cDNA的克隆质粒，由日本的Nohno教授(Kawasaki医学院分子生物所)提供•真核表达载体PCDNA3(neo)购自本校生物化学教研室•限制性内切酶及T4DNA连接酶均购口华美公司.DNA回收纯化试剂盒购口原平公司.1.2酶切鉴定及回收[3]将pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3(neo)用Hindlll和XbaI双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳分别得到0.6,2

3、.9和5.4kb的片段,用试剂盒回收纯化0.6kb和5.4kb的片段.1.3连接、转化和克隆筛选[3]取上述LBRK3k片段5uL和pCDNA3（neo）片段各2uL,加入T4DNA连接酶、缓冲液和无菌水各1uL,16°C连接过夜•制备大肠杆菌DH5a的感受态并转化•挑取单个菌落，液体LB培养基37°C振摇过夜，小提质粒，酶切鉴定筛选出阳性克隆，命名为pC-4.2结果2.1pSP64TL-tBRK3k和pCDNA3的酶切鉴定pSP64TL-tBRK3k质粒经双酶切后，得到2.9kb和0.6kb两个片段;pCDNA3（neo）经双酶切后，得到一个5.4kb的片

4、段，符合二者的物理图谱（图1）・图1略2.2pC-4的酶切鉴定pC-4经Hindlll和XbaI双酶切后，得到0.6kb和5.4kb两个片段，证明tBRK3k基因已成功连入到pCDNA（neo）中（图1）・3讨论TGF-P超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用，分别叫做I型受体（约50-55KD）和【[型受体（约70〜80KD）[4]•和其他TGF-B超家族成员一样，BMPs在细胞表面与I,II型受体相互作用•I型受体可以和过量的配体结合，而II型受体与配体的结合则是特异性的•因此，为研究BMPs信号转导在机体发育中的作用，我们将突变型BMPsII型受体(t

5、BRK3k)定向克隆到pCDNA3(neo)表达载体中(图2)・图2略PCDNA3(neo)可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因，全长5.4kb.其表达系统构件包括:CMV启动子，SV40复制起始点，SV40polyA,SV405'端和:T端剪切序列等，多聚接头有11个可供利用的单一酶切位点.PC-4真核细胞表达载体可用于研究BMPs信号对间充质细胞分化的调控，对于研究和阐明BMPs在机体发育中的作用有重要意义.参考文献：_1]WozneyJM,RosenV.Bonemorphogeneticproteinandmorpho-gcncticgonefamily

6、inboneformationandrepair[j].ClinOr-thop,1998;346:26-37._2]EstevezM,AttisanoL,WranaJLetal.Thedaf-4geneencodsabonemorphogeneticproteinreceptorcontrollingc.elegansdauerlarvadevelopment[J].Nature,1993;365:644-649.[2]J.萨姆布鲁克，EF•弗里奇，T.曼尼阿蒂斯•分子克隆实验指南[M]•第2版•北京：科学技术出版社,1992:34-56.[3]Heldin

7、CH,MiyazonoK,TenDijkeP.TGI7-PsignallingfromcellmembranetonucleusthroughSMADproteins[j]・Nature,1997;390(4):465-471.