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1、植物总蛋白提取及检测方法实验一植物蛋白提取——三氯醋酸•丙酮沉淀法取1-2克材料于液氮充分研磨，加入10mL预冷的含10%三氯乙酸（TCA）、0.07%P■筑基乙醇（对用DTT代替）的丙酮，充分混合后・20°C下冰浴过夜，然后离心（4°C,40000Xg,lh）,弃上清。在沉淀中加入10mL预冷的含0.07%DTT的内酮，充分混合，・20°C下放置lh,离心（4°C,40000Xg,lh）,重复该步骤2-3遍。沉淀冷冻干燥蛋白然后分装放入・80°C备用。取取纯化后的品体蛋04.0mg,加入400卩1
2、裂解液（lmg蛋0：100Ml裂解液）振荡器上振荡溶解，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70卩1,・80°C保存。按20uL/mg的比例加入蛋白裂解液（9mol/L尿素,4%CHAPS,1%IPG缓冲液,1%DTT,35mmol/LTris）,30°C水浴1h,并不时振荡,12OOOXg下离心10min。上清液中加入4倍体积的预冷丙爾，于・20°C下放置至少2h,4000Xg卞离心10min,沉淀用水化缓冲液（8mol/L尿素,2%CHAPS,20mmol/LDTT,0.5
3、%IPG缓冲液）溶解,重复该步骤1〜2遍。样品溶液存于・75°C下或直接用于电泳。川Bradford法在波长595nm定量蛋白。试剂：1、提取液：含10%TCA和0.07%B■疏基乙醇的丙酮。2、裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,IPGbufferlOOpl（35mmol/LtrislOOgl）使用前再加入IM的DTT65gl/ml（约50mg,现用现加）。3、液氮。实验二紫外吸收法检测提取蛋白的浓度一实验目的通过蛋白提取方法熟悉掌握使用酶标仪、紫外
4、可见分光光度计分析检测（或扫描）提取蛋口的浓度二实验原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯坏含有共辘双键，因此蛋白质具有紫外吸收的性质，其最大吸收峰在280mn波长处。在此波长时，蛋白质溶液的吸光度（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。由于核酸在280nm波长也有光吸收，对蛋白的测定有干扰，但核酸的最大吸收峰在260nm处。町同时测定280nm和260nm波长的光吸收，通过经验公式计算可消除其对蛋白质测定的影响。酶标仪其核心是一个比色计或分光光度计，一般要求测试液的最终体积在250卩1以下
5、。其基本工作原理与结构和紫外可见分光光度计儿乎完全相同。酶标仪是以微孔板为比色容器的比色计，入射光通过板孔底部进入比色液体，利用板的移动更换比色对象。紫外可见分光光度计测定样品容量大。三实验方法、步骤取lmgBSA用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含最。取7个10ml的离心管，首先在5个离心管小按次序加入0卩1,5卩1,10卩1,15川，20卩1的BSA溶解液，另2管中分别加入2卩1的待测样站溶液，再在每管中加入相应体积的纯水（总体积为100Ml）,然后，各管中分别加入5ml的Brad
6、ford液，摇匀，置室温5min后测定吸光值，在595nm下按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的0D值，再测样品0D值。以标准蛋白浓度为x轴，0D值为y轴作标准曲线。1234567BSA蛋白质标准溶液（pl）0510152022H20（卩1）100959085809898蛋白质浓度（mg/ml）00.050」0」50.2A595OD值实验三提取蛋白的脱盐纯化处理一实验目的了解蛋口质纯化的方法，熟悉学握蛋口脱盐处理的纯化方法二实验原理分离纯化某一特定蛋白质的一般程序町以分为前处理、粗分离、细分离三步
7、。（一）前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失纶物活性。为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醴等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞山于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或川纤维素
8、酶处理也能达到冃的。破碎细菌细胞壁的常川方法冇超声波破碎，与砂研辭、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎麻，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。如呆所要的蛋口主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利川超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。（二）粗分级分离当蛋口质提取液（
