《研究生实验》PPT课件

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1、实验二、ELISPOT—单细胞分析技术基础医学院免疫学教研室徐琦副教授ELISPOT简介ELISPOT是在ELISA技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。ELISPOT技术的发展ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。早期ELISPOT的分析条件不

2、是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。直到1996年PVDF薄膜的应用（Forsthuberetal.,Science,1996），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度。1996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良，ELISPOT分析技术已经逐渐

3、达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。ELISPOT与ELISA的比较它们最大的不同在于：1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。2.ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率;3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能

4、从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。4.刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞，经下列方法检测：ELISPOT细胞内细胞因子染色（FACS）ELISAX坐标：106APC中实际IFN-γ+T细胞数量Y坐标：各检测方法的检测结果ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较BDELISPOT技术优势单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子观察活细胞应答（动态）结果能计数效应细胞，分析效应分子产生频率＃ofSpots

5、:cellnumbers/frequencysizeofSpots:relativeamountproduced高灵敏度,高产量,大容量T细胞分析成为可行。只需要少量样本即可进行检测分析。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。BDELISPOT应用移植研究疫苗开发-亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响Th0/Th1/Th2细胞转换分析自体免疫研究–免疫调节及免疫治疗研究癌症研究-肿瘤反应T细胞作用过敏机制探讨–IL-4

6、诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞因子研究传染疾病研究体液免疫研究–B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究BDELISPOT原理1.ELISPOT实验设计是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodiumazide、内毒素endotoxin）的单株抗体。2.静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围

7、)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。3.微孔板中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素（Biotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。BDELISPOT流程1．针对被分析物的捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上2．用完全培养基将板底封闭3．细胞悬液加入Ag或有丝分裂素等刺激剂孵育一定时间以激活细胞――细胞分泌的蛋白紧靠在细胞周围，与已固定的捕获抗体结合4．孵育一定时间

8、后洗去细胞,分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获BDELISPOT流程5．加入生物素标记的针对被分析物的检测抗体――检测抗体与被分析物结合，形成‘夹心三明治’复合物6．加入与辣根过氧化物酶(HRP)连接的亲和素――亲和素与检测抗体上的生物素结合7.加入底物与酶发生显色反应，监测颜色斑点的形成，终止底物反应，室温风干，避光保存于封口塑料袋中直至分析颜色斑点BDELISPOT流程CoatingAb包被培养板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔