生物工业分析 第8章 高效液相色谱分析

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1、生物工业分析第八章　高效液相色谱分析第一节基本原理第二节液相色谱操作第三节应用实例高效液相色谱分析第一节　基本原理一、液相色谱过程1．流程图高效液相色谱的流程如图8-1所示。高压泵输送流动相和试样组分高速流过色谱分离柱时，具有不同分配系数的组分在两相间经过反复多次的分配平衡时被分离，通过检测器时被检测并给出信号。高效液相色谱分析高压输液泵高压泵是高效液相色谱的动力源，用来使液体流动相高速通过色谱分离柱以达到快速分析的目的。在高效液相色谱中，通常使用往复式柱塞泵，结构如图8－2所示。高效液相色谱分析梯度淋洗装置梯度淋

2、洗就是流动相中含有两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，使被分离组分在两相中的分配系数改变，达到提高分离效果，调节出峰时间的目的。两种方式来实现：外梯度（也称低压梯度）和内梯度（也称高压梯度），外梯度是在常压下，按一定程序将溶剂混合后再通过高压泵输入色谱柱；内梯度是利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。进样装置高效液相色谱是在很高的压力状态下工作的，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图8－3所示。高效液相色谱分析高效分

3、离柱高效液相色谱的分离柱具有很高的柱效，理论塔板数达每米3万。柱体为直型不锈钢管，内径l～6nm，柱长5～40cm。液相色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，因此柱较短。高效液相色谱分析高效液相色谱检测器紫外光度检测器最小检测量可达10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。其原理是基于试样中各组分对特定波长的紫外光有选择性吸收，组分浓度与吸光度之间服从朗伯-比耳定律，因此要求在测定波长处，流动相应无明显的吸收，而被测组分应有较大的吸光系数。紫外光度检测器有固定波长和可变波长两种，前者

4、的测定波长固定（254nm或280nm），适用于芳烃化合物的检测。后者可根据试样选择测定波长，方便灵活适用面广。紫外光度检测器的光路图如图8-4所示。高效液相色谱分析光电二极管阵列检测器，由211个（或更多）二极管组成阵列，各检测特定波长，将吸收后透过的紫外光束分光投射到二极管阵列上，用计算机快速处理，可获更多信息及显示吸光度、波长、时间三维立体谱图，如图8-5所示。高效液相色谱分析差示折光检测器差示折光检测器的最低检测量达10-7g·mL-1，对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。其原理是基于含有被测组分的流动相和纯

5、流动相的溶液折射率之差与被测组分在流动相中的浓度有关，可根据流动相折射率的变化，测定试样组份含量。高效液相色谱法还可利用其高效分离的特点，将柱后流出组分分别收集，蒸去流动相，获得难于通过一般方法制备的高纯度样品（色谱纯）。液相色谱制造技术要求高，仪器价格、操作、维护费用也相对较高，故远没有气相色谱的普及程度高。高效液相色谱分析2．高效液相色谱法的主要分离类型（1）吸附色谱（液--固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。分离原理是组分在两相间经过反复多次的吸附与解吸分配平衡。（2

6、）分配色谱（液--液分配色谱）：早期通过在担体上徐渍一薄层固定液制备固定相，与流动相一起构成液液两相，各组分在两相间分配系数的不同，经反复多次分配平衡而实现分离。现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。通常反应发生在硅胶表面的≡Si－OH基团上，形成硅氧碳键型（≡Si-O-C），硅氧硅碳型（≡Si-OSi-C），硅碳型（≡Si-C）,硅氮型（≡Si-N）四种类型。高效液相色谱分析（3）离子交换色谱：固定相为离子交换树脂（H+或OH-），流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子因它们

7、与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。（4）凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶色谱法又称凝胶渗透法、凝胶过滤法。当试样随流动相进入分离柱时，试样中的小分子扩散、渗透到孔穴内部，而大分子则被排阻在孔穴之外，不同大小的分子，可通过的孔穴大小、数目不同，走过的路径和需要的时间不同，被排阻的大分子首先被流动相带出，其他不同大小的分子依次流出。高效液相色谱分析二、色谱流出曲线试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱拄，经检测器转换为电讯号，然后用记录仪将各组分的浓度变化记录下来，即得色谱图。色谱图

8、是以组分的浓度变化作为纵坐标，流出时间作横坐标的，这种曲线称为色谱流出曲线。三、色谱中有关术语高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的，但有其不同之处。液相色谱法的流动相为液体，气相色谱法的流动相为气体。液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一、液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体