第3章 高效液相色谱分析

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1、第3章高效液相色谱分析法HPLC（HighPertormanceLiquidChromatography，）§3-1高效液相色谱法的特点§3-2基本理论和条件选择§3-3各类高效液相色谱法简介§3-4液相色谱的流动相§3-5高效液相色谱仪高效液相色谱法：流动相——液体（也称洗脱液）在经典色谱法的基础上引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏检测器，建立了分析速度快、分离效率高和灵敏度高的色谱方法。高压：150-350×105Pa高速：1-10mL/min高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫

2、外检测）、10-11g（荧光检测）§3-1高效液相色谱法的特点一、HPLC与GC差别1．分析对象的区别GC：适于能气化、沸点较低、热稳定性好的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。占有机物的20%（能测定）HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的80%2．流动相作用的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分

3、间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件主要差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）1．贮液罐2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置二、高效液相色谱仪流程图§3-2基本理论和条件选择基础理论塔板理论——平衡理论(与GC相同)速率理论——范第姆特方程也与气相色谱相同。速率理

4、论在应用上（HPLC与GC），各项强弱有别；但这方面即便同为GC，填充柱和毛细管柱也有别。基本概念与气相色谱一致，如保留值、分配系数、分离度等2）纵向扩散项讨论：（与GC对比）1）涡流扩散项(与GC相同)分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4-5个数量级，3）传质阻力项c.u1.固定相的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右三、HPLC法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（LSC）

5、二、液液分配色谱法（LLC）三、离子对色谱法（IPC）四、离子交换色谱法（IEC）五、离子色谱法（IC）六、空间排阻色谱法（SEC）§3-3各类高效液相色谱法简介1．分离原理固定相：固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。一、液固吸附色谱法（LSC）基本原理：流动相中的溶质分子（X）与溶剂分子（S）在固定相吸附剂上的竞争吸附：Xm+

6、nSa=Xa+nSm下标m、a分别表示流动相和固定相，n是被吸附的溶剂分子数。达到吸附平衡时，吸附平衡常数（K）可表示为：吸附平衡常数K值大，表明该溶质分子在固定相上被吸附的多，吸附作用强，该组分的保留时间长，分配系数也大。2．固定相：与GC比，固定相粒径不同（<10μm）（2）高分子多孔小球：YSG原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性

7、化合物固定相与流动相都是液体，相互不相溶。基本原理：组分在固定相和流动相上的分配，在两相中溶解度存在差异。即K或k的差异，导致分离。流动相：亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性(正相normalphase)，反之流动相的极性大于固定液的极性(反相reversephase)。正相与反相的出峰顺序相反。固定相：早期涂渍固定液，现已不采用。化学键合固定相：将基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，如C18柱（反相柱）。二、液液分配色谱法（LLC）1．分离原理2.固定相（1）全多孔型固定相：

8、由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体作为担体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。（2）表面多孔型固定相：（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。物理或机械涂渍法，固定液流失不可避免。（3）化学键合固定相：化学键合固定相：应