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1、超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆与鉴定作者：郝林，韩从辉，王跃闽，贡震，董秉政，胡建鹏【摘要】目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)全长基因并构建其表达载体。方法采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长序列共771bp,克隆入pUC57载体中，进行酶切及测序鉴定。结果克隆了SEA全长基因，经测序证实与Genbank中收录的SEA基因序列完全一致。结论本研究成功地克隆了SEA全长基因，为进一步研究SEA基因的靶向抗肿瘤研究奠定了实验基础。【关键词】金黄色葡萄球菌;肠毒素;克隆;序列分析Clo
2、ningandidentificationofthegeneencodingthesuperantigenstaphylococcusenterotoxinAHAOLinl,HANConghuil*,WANGYuemin2,GONGZhenl,DONGBingzhengl,HUJianpengl(1.DepartmentofUrology,XuzhouCentralHospital,Xuzhou,Jiangsu221009,China;2.DepartmentofUrology,Affi1iatedEastHospital,TongjiUniv
3、ersity,Shanghai200120)Abstract:ObjectiveToclonethefull-lengthgeneofstaphylococcalenterotoxinA(SEA)andconstructitsexpressionvector.MethodsThetechniqueofpolymerasechainreaction(PCR)wasemployedtoobtain771bpful1-lengthsequenceofSEAfromthegenegroupDNAofstandardstrainATCC13565.The
4、SEAgenewasamplifiedandinsertedintocloningvectorpUC57.ThestructureofrecombinantpUC57-SEAplasmidwasconfirmedbyrestrictionendonucleaseandsequenceanalysis.ResultsThe771bpDNAsequencingshowedthattheDNAsequenceoftheclonedgenewasidenticaltothedatarecordedinGenbankDatabase.Conclusion
5、Thisstudyhassuccessfullyamplifiedandclonedtheful1-lengthgeneencodingSEAtoxinandestablishedabasisfortheSEAgenetargetforantitumorresearch.超抗原(superantigen,SAg)是一组细菌或病毒编码的蛋白质分子，可不需要抗原提呈细胞(antigen-presentingcell,APC)的提呈作用，以完整的蛋白质分子形式直接与APC膜的MHC-II类分子抗原结合槽外侧结合并且提呈给T细胞[1]oSAg-MHC-
6、II类分子复合物仅与T细胞抗原受体(TCR)(3链的V区相结合[2],由于人类V
7、3基因有20余种，故SAg激活的T细胞克隆数可达普通抗原的数千倍乃至数万倍。超抗原的抗肿瘤作用主要是由SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen-dependentedcellulartotoxicity,SDCC)来完成，这是超抗原抗肿瘤的主要作用。再者，SAg激活的CD4+T细胞还可以分泌多种足量的细胞因子，如：肿瘤坏死因子(TNF)-a.TNF-(3和INF-y、白细胞介素(口)-2、IL-6等[3],直接或间接地杀伤肿瘤细胞。本研究克隆超抗
8、原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)全长基因，为进一步研究超抗原SEA基因片段在抗肿瘤中的作用提供实验基础。1材料和方法1.1材料产SEA金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565购自中国药品生物制品检定所，大肠埃希菌JM109和质粒pUC57为Sangon公司产品°T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶和限制性内切酶EcoRV、KpnKHindIII均购自Takara公司，质粒小量提取试剂盒购自Invitrogen公司,其余试剂均为分析纯。1.2SEA基因的PCR扩增以产SEA的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板，进行PCR扩增，根据G
9、enBank已知的SEA基因序列设计一对引物：上游引物为5Z-CCAATATGAAAAAAACAGCAT-3,，其中CCAAT为保护性碱基;下游引物为
