菌种划种LB琼脂平板检查标准操做规程

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1、菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程依据：《屮华人民共和国药典》2005年版第三部。范围：适用于人肠杆菌表达的重组人基因工程产品。目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。内容：1材料1.1材料1.1.1菌种:PBV888/DH5a,来源于主种子批或工作种子批。1.1.2注射用水：符合《屮华人民共和国药典》2005年版的要求。1.1.3药品氯化钠NaCl分析纯琼脂粉分析纯酵母粉蛋口腺无水乙醇C

2、H3CH2OH分析纯1.1.4器皿平皿、三角烧瓶(3L)、量筒(1L)、玻棒、试剂瓶。1.1.5其它材料线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。1.2仪器设备牛物安全台II级A型安徽蚌埠净化设备厂恒温培养箱HG303-5B型湖北省黄石市1矢疗器械丿扭力天平2方法2.1准备工作TN-100B型上海第二天平厂1.1.1牛产环境：在十万级洁净间进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。2.1.2器皿的洁净要求玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3°

3、C60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3°C60分钟。2.1.3调试仪器设备2.1.3.1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2.1.3.2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。2.1.3.3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。2.2溶液的配制2.2.1LB琼脂培养基的配制1000ml摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白陈10克，NaCl10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml,用玻棒搅匀

4、，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制吋间，115.6°C30分高压灭菌。2.2.275%酒精溶液1000ml取750ml无水乙醇，加注射用水定容1000ml,混匀，装入试剂瓶中，贴标签,标明液体名称、浓度、配制日期，室温备用。2・3操作步骤2.3.1摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基冷却至50°C左右，倒平板，每皿20-30ml,待凝固后，放入恒温培养箱中，37°C倒置培养24小时，如无

5、杂菌生长，即可继续实验用。2.3.2划线分离：用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取1环菌种于LB平板上划线分离。2.3.3将划线分离的平板置于37°C恒温培养箱中培养24小时。2.3.4操作结束后，场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。3结果判定3・1判定标准：菌落形态如为圆形，湿润、光滑，中等大小（直径约2-3mm）,即为典型大肠杆菌菌落。1.2判定结果判定结果经二人复核后，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。4清场2.1配液清场4.1.1药品称量之后，将药品

6、瓶盖紧，放回原处。4.1.2将扭力天平处理干净，放回原处。摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌。并填写使用记录。4.1.3生物安全台内用75%酒精棉擦拭干净，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。4.1.4操作台面用专用抹布擦干净。4.2操作清场4.2.1将带有细菌的LB平板送高压灭菌（121.3°C60分钟），灭菌后将平皿内容物倒入垃圾桶中。4.2.2玻璃器皿用纯化用水冲洗干净，送木室洗刷组处理。4.2.3清场合格后，由车间工序负责人或质量监督

7、员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，“清场合格”标志牌，并填写清场记录。5注意事项5.1清场时，必须将带有细菌的平板先送高压灭菌处理后再送到洗刷组处理。5.2所有工作均应二人复核，并填写工作记录。