菌种生化反应检查标准操作规程

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1、菌种生化反应检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基屮仅含一种氮源（钱盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢钱作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此口J否利用该盐，能将不同细菌鉴别。I卵朵试验原理：有些细菌具有色氨酸猶，能分解蛋白腺中的色氨酸牛成眄際，卵朵木身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与口引味作用形成

2、红色的玫瑰口引味。甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱竣生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黃色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解内酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱竣变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后

3、者又与培养基蛋白腺屮精氨酸所含弧基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。内容：1材料、设备1.1材料：1.1.1菌种：PBV888/DH5n,来源于主种子批或工作种子批。1.1.2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。1.1.3试剂蛋白豚氯化钠NaCl分析纯葡萄糖CgH^Og分析纯渙麝香草酚兰C2?H28Br20oS分析纯对二甲基氨基苯甲醛C9HhN0分析纯戊醇c5h15o分析纯浓盐酸IIC1分析纯甲基红C15H15N3O2分析纯无水乙醇CH3CH2OH分析纯氢氧化钠NaOH分析纯氢氧化钾KO

4、H分析纯«-蔡酚CJbOIl分析纯硫酸镁MgS04*7H20分析纯磷酸氢二钾K2HPO1分析纯磷酸二氢镀讯时0」分析纯枸椽酸钠C6H5Na307•2H20分析纯琼脂粉分析纯1.2器皿盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒(100ml.500ml、1000ml).吸管(10ml)、试剂瓶(250ml、500ml)o1.3仪器、设备PII计PIIC-3C型上海大中分析仪器厂电子秤ES-200A型沈阳腾龙屯子仪器公司电子天平ACS太原恒温培养箱HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂水浴箱6LiterLKB生物安全台II级

5、A型安徽蚌埠净化设备厂1.4其它材料硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球(1ml及10ml)玻棒、接种环、透气栓。2方法2.1准备工作2.1.1工作环境：在十万级洁净室内进行，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。2.1.2器皿清洁要求经木室洗刷间处理烤干后用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，经121.3C,60分钟高压蒸汽灭菌备用。2.1.3调试仪器设备2.1.3.1确认PH计运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2.1.3.2确认电子秤运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2.1.3.

6、3确认电子天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2.1.3.4确认培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。2.1.3.4确认水浴箱运行状态良好。已挂冇“备用”标志牌。2.1.4溶液及培养基的配制：2.1.4.1INNaOH100ml摘下电子秤“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。用电子秤称取NaOH4克,加注射用水80ml溶解,用量筒定容至100ml,置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2.1.4.21%的浪麝香草酚兰(BTB)100ml摘下电子天平“备用”标志牌，挂

7、上“运行”标志牌，接通屯源，校零。用电子天瓶称取1克渙麝香草酚兰，加INNaOH1.6ml,加注射用水定容至100mlo置试剂瓶中,标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2.1.4.30.4%的混麝香草酚兰(BTB)100ml用电了天平称取浪麝香草酚兰0.4克加INNaOII0.64ml,加注射用水至100ml装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制F1期，放室温待用。2.1.4.495%乙醇500ml量取475ml无水乙醇，加注射用水定容500ml,装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、

8、配制日期，放室温待用。2.1.4.5甲基红试剂500ml用屯子天平称取甲基红0.1克，溶于95%乙醇300ml,然后加注射用水定容至500ml,置试剂瓶屮，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。2.1.4.6枸氏试剂100ml摘下水浴箱“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，设定56°C,预热。用电子天平称取对二甲基氨基苯甲醛5克，加入