菌种保存、传代、使用、销毁实用标准操作规程

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1、标准实用菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。3、定义Ø标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。Ø传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。Ø工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。Ø菌种的代是指将其

2、接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。4、职责4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标

3、准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。5.3菌种的保存5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6文档大全标准实用个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。5.3.2传代

4、用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。5.3.2.1甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方

5、法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。5.3.2.2液体石蜡保存法5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌

6、、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1表1传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限菌种名称保存方法保存温度保存期限大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕甘油冷冻管-30℃2年金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104）枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B)50094〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕液体石蜡管2-8℃1年黑曲霉菌〔CMCC(F)980035.4菌种的处理和保藏5.4.1标准菌株的复苏、

7、确认、传代5.4.1.1标准菌株的复苏5.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培养基文档大全标准实用Ø改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮；Ø液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮；Ø营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；Ø改良马丁培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮5.4.1.1.3标准菌株的复苏操作步骤：以下操作均在生物安全柜内进行。a)在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。b)用一小砂轮在安瓿

8、的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。c)以无菌