实训三 MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌

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1、实训三 MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌一、实践目的通过本实训，学会配制大量元素、微量元素、铁盐、维生素、生长调节剂等培养基母液。通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。通过对培养基和培养用具的灭菌，掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的一般操作技术。二、实践用具与材料移液管、电炉、PH试纸、培养瓶、标签、铅笔、量筒、烧杯、容量瓶、广口瓶、玻棒、电子天平、托盘天平、棉花、报纸等用具。硝酸铵、硝酸钾、EDTA、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、IAA、BA等药品、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH、0.1

2、mol/L的HCL、95%酒精三、实践学时与场地10学时，植物组培实验室。四、实践内容（一）三角瓶棉塞的制作棉塞的作用有：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。要求：形状，大小，松紧适度制作：（1）取一大小适当的纱布，将其中心铺于三角瓶口，任其自然下垂至外壁，用玻璃杯将纱布向瓶内推进，至棉塞所需长度，握住瓶壁及纱布，取适量棉花向内填塞并压紧（2）将棉塞尾部加适量棉花并压紧，使其略大于瓶口，收紧尾部纱布，并用棉线扎进，剪去多余线头和纱布，棉塞制作完毕（3）使用时，再用牛皮纸或二层报纸包扎好（二）培养基母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩

3、液，一般配成比所需浓度高10—100倍的溶液。优点：（1）保证各物质成分的准确性。（2）便于配置时快速移取。（3）便于低温保藏。1、步骤⑴测定各类母液保存容器容量，记录。⑵根据记录设计各种母液所配浓度倍数和制培养基时取用量⑶计算各种药品所需用量⑷称量药品大量元素等大于0.1g用托盘天平称量，微量元素等小于0.1g用电子天平称量。⑸溶解⑹定容⑺写上标签⑻装瓶将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。注意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。（9）冰箱保存。2、母液配方MS培养基配方=见教材⑴

4、MS大量元素母液（10X）称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液100ml。⑵MS微量元素母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。注意：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按10倍量，即0．25mgX10=2．5mg（100倍量25mg）称取后，定容于100ml水中，每次取1ml（0.1ml，即含0．25mg的量）加入到母液中。⑶MS铁盐母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDT

5、A盐较难完全溶解，可适当加热，并将pH调至5.5。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。⑷MS有机物母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。⑸生长调节剂单独配制，浓度为1-5mg/ml（书中为0.5-1mg/ml），一般配成4mg/ml。溶解生长素时，可用少量0．5–1N的NaOH(6-BA)或1ML95%酒精(2，4-D和NAA)溶解，溶解分裂素类用0．5–1N的HCl加热溶解。⒊配制培养基母液时注意事项：①某些

6、离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶解，在按配方顺序依次混合；②配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水；③药品应用化学纯或分析纯；（三）培养基的制备1.步骤⑴本次实验要求制作培养基数量1L培养基成分用量10X大量元素母液100ml100X微量元素母液10ml1000XCoCl2·6H2O母液1ml1000XCuSO4·5H2O母液1ml100X铁盐母液10ml100X有机物母液10ml蔗糖30g琼脂10g⑵根据制作要求计算培养基各种母液的用量。3、按下列母液的顺序，用量筒或移液管提取母液，放入有一定蒸馏水的烧杯中。4、加入固化剂：称量10

7、g琼脂，溶解，在电炉上不断加温溶液，并不断搅拌，使琼脂熔化。5、加糖：放入30g已称量蔗糖，稍加搅拌。6、加入生长调节物质，激素类型和用量视培养物不同而不同。7、定容：定容至所需升数。8、调整PH值：迅速用PH试纸测试PH，应该在5.8-6.0之间，如过高，则滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。9、培养基分注：趁热将配制好的培养基分注到培养瓶中，每瓶装入20-35ML左右的培养基。分注后立即加盖，贴上标签，注明培养基的名称和配制时间。（四）、灭菌1、高压蒸汽灭菌⑴包扎  用牛皮纸、纱布把玻璃器

8、皿和金属器械包扎好。⑵装水  先在高压灭菌锅内装入一定量的水，需淹没电热丝。⑶灭菌  将装好培养基的培养皿、包扎好的玻璃器皿和金属器械、放入高压灭菌锅。压力升至49kPa时，打开排气阀排冷气，关闭排气阀继续加压至108kPa, 锅内温度为12-10