常用研究细菌的实验技术

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1、9.2常用研究细菌的实验技术大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体來研究其属性,微牛物的物种(菌株)一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中，在人为规定的条件卜•培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture),而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pureculture)o由于在通常悄况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态屮分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微牛物研究的另

2、一项重耍技术，因为绝大多数微牛物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。显微技术包扌舌显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方而的内容。实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微牛物世界，并真正使对微牛物的研究发展成为一门科学。9.2.1微生物的分离和纯培养9.2.1.1无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用屮,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微纶物群中分离出特立的微纶物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养

3、纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptictechnique),它是保证微生物学研究正常进行的关键。(1)微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平JUL(culturedish,Petridish)等是最为常用的培养微生物的器具,在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何牛物。培养微牛物的营养物质[称为培养基(culturemedium)]nJ'以加到器皿屮厉一起灭菌，也町在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所冇的生物，包押;最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。

4、有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气屮的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需釆用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也町采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只nJ让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是山止反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。(2)接种操作用接种环或接种针分离微生物,或在无菌条件下把微生物山一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微牛物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微牛•物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无

5、菌操作(图2-1),或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作(图2-2)。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。图2-1无菌操作转接培养物a・接种环在火焰上灼烧灭菌b.烧红的接种环在空气中冷却，同时打开装有培养物的试管c.用接种环沾取一环培养物转移到一装冇•无菌培养基的试管中，并将原试管重新盖好d.接种环在火焰上灼烧，杀灭残留的培养物图2-2无菌操作箱示意图左：生物安全超净柜右：小型无菌箱用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，-•般采用易于迅速加热和冷却的碌銘合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭

6、菌。而转移液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。9.2.1.2用固体培养基分离纯培养单个微牛物在适宜的固体培养基表面或内部牛长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落(colony)o当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔(lawn)。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据(图2-3)o大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的干板分离法很容易得到纯培养。所谓严板，即培养干板(cultureplate)的简

7、称，它是指熔化的固体培养基倒人无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微牛物分离和I古I定在I古I体培养基表而或里而。I古I体培养基是用琼脂或其他凝胶物质I古I化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成茵落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用于板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年來一直是各种菌种分离的最常用手段。图2-1无菌操作转接培养物a・接种环在火焰上灼烧灭菌b.烧红的接种环在空气中冷却，同时打开装有培养物的试管c.用接种环沾取一环培养物转移到一装冇•无菌

8、培养基的试管中，并将原试管重新盖好d.接种环在火焰上