KJ 201905 水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法

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1、附件5水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201905）1范围本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。2原理本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。3.1试剂3

2、.1.1正己烷。3.1.2丙酮。3.1.3乙酸乙酯。3.1.4乙腈3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。3.1.7氯化钠3.1.8复溶液：称取0.12g磷酸二氢钠(3.1.5)置于100mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16g(3.1.6)置于100mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A2.8mL、溶液B7.2mL、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至100mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。。3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙

3、酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。3.2标准物质氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。表1氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量5氯霉素Chloramphenicol56-75-7C11H12Cl2N2O5323.13注：或等同可溯源物质。3.3标准溶液配制3.3.1氯霉素标准储备液（1mg/mL）：

4、精密称取氯霉素标准物质（3.2）10mg，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。3.3.2氯霉素标准中间液A（10μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。3.3.3氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10μg/mL）（3.3.2）0.01mL分别置于10m

5、L容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。3.4材料3.4.1固相萃取小柱：CleanertSilica，200mg/6mL。LOT：0170198。3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。3.4.2.1金标微孔。3.4.2.2试纸条或检测卡。4仪器和设备4.1移液器：200μL、1mL和5mL。4.2涡旋混合器。4.3离心机：转速≥4000r/min。4.4电子天平：感量分别为0.01mg和0.01g。4.5样品浓缩仪：如有需要。4.6环境条件：温度：

6、15～25℃，相对湿度：≤60%。5分析步骤5.1试样制备取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。5.2试样提取和净化准确称取试样6g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入1mL水和8mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5min，以4000r/min离心5min。转移全部乙酸乙酯层于50mL具塞离心管中，加入正己烷25mL，氯化钠1g涡旋混匀，4000r/min离心1min，上清液待净化。5mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液

7、，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液。5.3测定步骤5.3.1检测卡与金标微孔测定步骤吸取150µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8min，对结果进行判定。5.3.2试纸条与金标微孔测定步骤吸取150µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，

8、抽吸5～10次使混合均匀，室温温育35min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，