实验六RNA提取和RT-PCR

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1、实验六植物RNA的提取和RT-PCRRNA研究的重要性DNA、RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起着重要的作用，rRNA和tRNA同样在蛋白质的生物合成中发挥着不可替代的作用。RNA在不同组织部位的分布情况RNA提取材料一般情况下：也可以进行下面处理进行保存：RNA提取过程中的注意事项1、杜绝外源RNA酶的污染：A、戴好手套，在实验过程中禁止大声说话，必要时要求带口罩；B、实验中涉及的离心管、Tip枪头均要求事先用氯仿

2、处理；C、实验台面要求清洁干净；D、实验中的试剂要求无RNA酶2、阻止内源RNA酶的活性：A、选择合适的匀浆放方法；B、选择合适的裂解液；C、控制好样品的起始量。RNA提取中的污染源手枪头水和溶液实验台面内源性的RnaseRNA样品RNA保存几种RNA提取方法1、TRIzol法2、苯酚法3、异硫氰酸胍-酚法苯酚法提取RNA的原理细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA和蛋白质分离并除去。将细胞置于含有SDS的缓冲液中，加入等体积的水饱和酚，通过剧烈振

3、荡，然后离心，形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。异硫氰酸胍-酚法提取RNA的原理GIT与巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基氨酸钠作用使蛋白质变性，从而释放RNA。酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提取RNA纯度高、完整性好，适合纯化mRNA、逆转录以及构建文库。TRIzol法实验步骤1．100mg植物组织在液氮中研磨充分。2．加入1000μlTRIzol试剂，反复颠倒

4、混匀。3．上述混合物在室温放置5分钟。4．加入0.2ml氯仿，振荡混匀15秒。5．将离心管在室温放置2-3分钟，4℃，12000rpm条件下离心15分钟。6．将上层溶液转移到新的离心管中，加入500μl异丙醇混合均匀后室温放置10分钟进行沉淀,离心。7．移走上清，并用70%乙醇清洗RNA沉淀一次。8．室温干燥或者真空干燥RNA沉淀；然后，将RNA沉淀溶解在无RNase的水中，并保存在-70℃。DNA消化（可选择）取提取的RNA产物8ml到离心管中，置于冰上，加入1mlDnase和1ml10×DNa

5、se缓冲液，37℃水浴锅中温育30分钟。加入1ml终止缓冲液，在65℃中终止反应10分钟。RT-PCR的原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基

6、因组DNA的污染。RT-PCR中cDNA的合成a.以oligo(dT)为引物：oligo(dT)可与mRNA分子3’末端的poly(A)序列相结合，有效的引发cDNA第一链的合成，对mRNA具有高效的特异性。由于其cDNA第一链的合成起始于mRNA3’末端，需越过较长的3’端非编码区才能到达编码区，较长序列的mRNA(>3kb)分子较难得到全长的cDNA。b.以随机六聚体的核苷酸为引物：当特定mRNA中由于含有使反转录酶终止反应的序列或mRNA分子较大且3’端非编码区序列较长难以得到全长序列的cD

7、NA或完整的读码框时，常采用六聚体随机引物拷贝全长的cDNA。当使用随机引物时，cDNA第一链的合成可能起始于mRNA上的许多部位，从而保证得到mRNA的编码区和5’端旁侧。c.以特异的寡核苷酸为引物（一步法RT-PCR）：这是最特异的cDNA合成方法，如果PCR反应采用两个特异引物，cDNA第一链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。仅产生需要的cDNA，并导致更为特异的PCR扩增。逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖R

8、NA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。RT-PCR特异基因引物的选择遵循一般引物设计的原则；合成产物一般在300bp以上，避免产物小导致电泳扩散；一般5’和3’的引物在不同的外显子上面，扩增出的片段大小可以和以基因组为模板扩增的产物相区分，可以检测提取的RNA中是否有DNA的污染。RT-PCR的