体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂

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1、3.2.5体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml离心管里，在天平上仔细平衡到10g,在4°C,lOOOOrpm,离心10min,小心转移上清液到新管子里标记备用。（1）对超氧阴离子的清除作用利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。取50mmolf的Tris-HCI缓冲液3mL(pH=2含有2mmol-L-i的NazEDTA)，加入ImL待检样品，于25°C保温10min,然后加入25°C预温的5mmol丄的邻本二-1酚0.3mL（预先用10mmol-L的盐酸配制），精确反应4min,用0.5mL浓盐酸

2、终止反应，测定其在320nm下的吸光度。以10mmol-L的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除韦：_）=X、亠r人—A-AA样品牢白清除率对照样品100%A对照（1）式中A对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL10mmohL1的盐酸替代样品）；A和为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0・3mL10mm0l_L1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。注意事项:K所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q”，或“S”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着

3、“G”。2、测定前要用100g舷码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5%，不是5%。3、测定大量数据前，使用者先配制10g/L的Vc,做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。4、测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。（2）对DPPH.的清除作用DPPH-溶液的配制：准确称取47mgDPPH-,用无水乙醇溶解并定容至100AmL,避光保存（0〜4°C）使用吋稀释至120^nol丄。取待检样品ImL与一1的DPPH.溶液3mL加入同一试管中，摇120/molL匀，在黑暗中放置30min,以无水乙醇为

4、空白，在517nm下测定其吸光度，并按下式计算清除率：='清除率A对照・a样品A样品空白100%A对照（2）式中A对照为未加待检样品的DPPH-反应体系的吸光度（用1mL无水乙醇补充体积）；A样品为加入待检样品后的DPPH•反应体系的吸光度；A样品空白为加入待检样品后的无DPPH-的反应体系的吸光度（用3mL无水乙醇补充体积）。上述是针对那些遇酒精不浑浊的情况注意事项：1>本实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的，但是两个比色皿要一致。石英的，上面会写着“Q”，或“S”；玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着“G”。如果样品遇到酒精大量浑

5、浊，则DPPH.溶液的配制：准确称取47mgDPPH・，用无水乙醇溶解并定容至100mL,避光保存（0〜4°C）,使用时稀释至120/mol丄「1。取待检样品ImL与一1的DPPH.溶液3mL加入同一试管中，摇120ahioIL匀，（-）在黑暗中放量36FirH鈕*在517nm下测定其吸光度，并按下式计算清除率：清除率八对照A样品A样品空白go%A对照（2）式中A对照为未加待检样品的DPPH-反应体系的吸光度（用1mL纯水补充体积）；A样品为加入待检样品后的DPPH-反应体系的吸光度；A样品空白为加入待检样品后的无DPPH-的反应体系的吸光度

6、（用3mL纯水补充体积）。（3）对疑自由基的清除作用在一系列50mL具塞试管中加入0.8mL的HAc—NaAc缓冲溶液4mol丄-1),2.2(0.2mol/L,pH=5.0),1.0mL的孔雀绿溶液(100mL,纯水配制，1x10mL的EDTA_Fe2+溶液(2x10-2molL「,注意不要吸入底部沉淀，沉淀太多则滤纸过滤后使用，以防止不均匀)，1.4mL的H2O2溶液(体积分数为0.3%,每次用新的，不超过一个月)，用去离子水稀释到10mL并涡旋振荡混匀，放置45min后，在617nm下测定其吸光度Ab，同时测定不加H2O2时体系在617

7、nm下的吸光度如Ao,则轻自由基的产生量AA=A0-AboAA越大，表示生成的疑自由基越多。上述体系中加入H2O2之前放1mL待测样品，测定其吸光度As,则轻自由基清除率可按下式计算：清除率x100%(3)式中Aso为加入待测样品后未加H2O2的反应体系的吸光度。注意事项：1>本实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的，但是两个比色皿要一致。石英的，上面会写着“Q”，或“S”；玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着“G”。2、H2O2要稀释十倍再使用，母液是3%的尽量用新买的双氧水。3、EDTA-Fe2+溶液有浑浊和沉淀，影响实验效果，配置

8、后，立即一层滤纸过滤，用滤液测定，每次测定时注意底部有无沉淀，和结晶析出，如有，请过滤后使用，以保证每个试验点的试剂是均一的。4、孔雀绿溶液按需配置，因为含铜离子。