管碟法抗生素微生物检定法讲座

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1、-抗生素微生物检定法讲座————管碟法基本原理：一、管碟法测定抗生素效价原理：管碟法测定效价，是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，将已知效价的标准溶液与未知效价的供试品溶液，在同一条件下，在摊布高度敏感的特定试验菌的培养基上进行对照培养，经过一定时间后，抗生素在培养基内扩散到达适当范围产生了抑制试验菌生长的透明抑菌圈。经比较标准液与供试品液两者产生抑菌圈直径或面积的大小，根据不同设计方法的计算原理，即可推算出供试品的效价。二、效价测定计算公式──二剂量法及其推导：1、抑菌圈形成原理：当小管内加入抗

2、生素溶液后，即产生两种互动因素：一是抗生素溶液向培养基内呈球面形扩散；另一种是试验菌开始生长。抗生素在琼脂培养基内的浓度，随离开小管距离的增大而降低，离开小管愈远，琼脂培养基中抗生素浓度愈低，当抗生素扩散到一定时间，抗生素浓度高于最低抑菌浓度之处，试验菌的生长受到抑制，形成透明抑菌圈，圈之边缘处恰好为抗生素最低抑菌浓度。2、二剂量法公式推导：管碟法球面扩散公式：2r＝4DT〔LnM/H-Lnc＇-Ln(4πDT)〕2整理得：LogM＝r/9.21DT+Logc＇4πDTH⑴其中：D:扩散系数r:抑菌

3、圈半径M:抗生素总数T:扩散时间c＇:最低抑菌浓度H:培养基厚度此公式即为直线方程LogM＝bY+c其中:b＝1/9.21DT，c＝Logc＇4πDTH。b为斜率，c为截距此公式为管碟法测定抗生素效价的基础，它表明对数剂量LogM与抑菌圈半径的平方成直线关系，这就是抗生素微生物效价检定法(管碟法)的理论依据。由公式⑴得：12标准品高剂量与抑菌圈关系式：LogM2＝────S2+Logc＇4πDTH①9.21DT1/2供试品高剂量与抑菌圈关系式：LogM2＝────T2+Logc＇4πDTH②9.21

4、DT12标准品低剂量与抑菌圈关系式：LogM1＝────S1+Logc＇4πDTH③9.21DT1/2供试品低剂量与抑菌圈关系式：LogM1＝────T1+Logc＇4πDTH④9.21DT因标准品与供试品同质，最低抑菌浓度c＇相同，又在同一双碟上培养Logc＇4πDTH相等，所以②-①得：M2＇122Logθ＝Log───＝────(T2-S2)ⅠM29.21DT其中θ为供试品与标准品效价比率。同理可推算出低剂量反应式：M1＇122Logθ＝Log───＝───(T1-S1)ⅡM19.21DT12

5、222Ⅰ+Ⅱ得：2Logθ＝───〔(T2-S2)+(T1-S1)〕Ⅲ9.21DT(①+②)-(③+④)得：//2222(LogM2+LogM2)-(LogM1+LogM1)＝────(S2+T2-S1-T1)9.21DT即/M2M212222Log——+Log——＝─────(S2+T2-S1-T1)/M1M19.21DTM2M2＇设I为高低剂量比的对数。则I＝Log───＝Log───M1M1＇122222I＝────(S2+T2-S1-T1)Ⅳ9.21DT2222LogθT2-S2+T1-S1

6、Ⅲ/Ⅳ得───＝────────Ⅴ2222IS2+T2-S1-T1此为二剂量法效价计算公式，其中S1、S2、T1、T2分别为低浓度标准、高浓度标准、低浓度样品、高浓度样品产生的抑菌圈半径。实验证明：对数剂量与抑菌圈直径或面积在一定条件下呈直线关系，所以为工作方便在实际工作中把半径的平方改为抑菌圈直径或面积，公式变为：LogθT2-S2+T1-S1───＝───────⑵IS2+T2-S1-T1式中：θ＝供试品与标准品的效价比率；T1＝低剂量供试品所致的抑菌圈直径的总和；T2＝高剂量供试品所致的抑菌圈

7、直径的总和；S1＝低剂量标准品所致的抑菌圈直径的总和；S2＝高剂量标准品所致的抑菌圈直径的总和；I＝高低剂量比的对数。此为工作中所用的二剂量法效价计算公式。三、一剂量法及其公式推倒：管碟法操作条件的控制一、抑菌圈圆正的控制：在某些情况下，抑菌圈出现破裂、不圆呈卵圆或椭圆形甚至无圈现象，原因主要有：①滴样时药液飞溅。此操作会导致抑菌圈破裂。防止方法是：毛细滴管内不得有气泡，毛细滴管口避免太细或太粗，毛细滴管离小钢管口距离不要太高，应适当调节，使液滴下滴时不致溅出。另外，若发现有液滴溅出可用以下方法来补

8、救：预先备好消毒小滤纸片，将溅在琼脂培养基表面的液滴用小滤纸片轻轻吸去。②小钢管底部二端面不平，此操作会导致形成卵圆或椭圆形抑菌圈。其原因是抗生素溶液在琼脂培养基上扩散速度不一致。操作时使用加工相同的小钢管可防止此现象的发生。③双碟、小钢管或其它器具被抗生素或其它杀菌剂污染。此操作会使抑菌圈破裂，有时甚至使试验菌大部或全部被抑制，无法形成抑菌圈。因此，操作时一定要防止材料、器具、环境被抗生素污染。④加菌层时培养基温度过高或受热时间过长，试验菌部分或全部被杀死。此操作会