gd基因的克隆与表达

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1、万方数据巾国动物检疫2006年第23卷第7期t栏目主持人：胡藕祥文章编号：1005—944x(2006)07一0027-03牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达曲光刚1-≈单虎1)★张志4李晓成妒郭丽鼹日f1山东莱阳农学院动物科技学院青岛2652192．中国动物卫生与流行病学中心青岛2660323．扬州大学兽医学院扬州2250091摘要：构建pET32a重组表达载体，转化到BL21∞E3)，诱导表迭牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRv的—)基因序列设计一对特异性引物，通过PcR方法扩增一条766bp的目的基

2、因gD，将gD基因克隆到原核表达载体pet32a，得到重组表达载体pet32一gD，转化到BL21(DE)中，通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后，免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；牛；gD蛋白；原核表达牛传染性鼻气管炎fIBRl是由牛传染性鼻气管炎病毒fIBRvl又名牛疱疹病毒I型、坏死性鼻炎病毒、传染性脓疱外阴一阴道炎病毒引起牛的一种急性、热性、接触性传染病．以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎和上呼吸道炎症为主要特征．还引起母牛流产和死胎、肠炎及小牛脑炎，有时发

3、生结膜炎和角膜炎。本病的病原体是牛传染性鼻气管炎病毒．又称牛疱疹病毒1型．属于疱疹病毒．n疱疹病毒亚科水痘病毒属。病毒粒子呈圆形．由162个壳粒组成正20面体．直径约130—180nm．由核芯、衣壳和囊膜三种微细结构组成．50年代在美国首次发现本病．目前在世界范围内流行，是造成养牛业经济损失的主要原因之一。EuSA等检测手段为检测IBRv提供了一条灵敏快速的方法．可以及早发现病毒．防止IBRv在牛群中大量传播，把经济损失降到最低点。本试验在大肠杆菌中高效表达了zD基因部分抗原表位，为IBRvEusA诊断方法的建立打下基础。1材

4、料和方法★通讯作者1．1质粒和菌株表达载体DET32a由本实验室保存．DH5Ⅱ、大肠杆菌B12lfDE3)菌株购于大连宝生物公司：1．2酶和相关试剂TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、限制性内切酶HindⅢ、BamHI购自Taka船公司：DNA快速纯化回收试剂盒购自上海生物工程公司：IBRv阳性血清由本实验室保存。1．3病毒扩增IBRV(bathNu／57株购白中国兽药监察所)接种到MDBK细胞．培养36—72h后．待70％左右的细胞出现细胞病变(cPE)时，收获细胞及上清液．反复冻融3次．离心后去沉淀．将上清液用

5、于核酸提取。1．4病毒DNA的提取参照试剂盒说明进行。1．5引物设计和合成根据已发表的gD基因序列，采用Drimer5．0软件．设计合成如下特异性引物r下划线部分表示引入的酶切位点、．Pet—l：5’ATGGATCCCTCGGACTGATrA‘『1GGCG3’Pet一2：5’GCAAGCTTTGTA(丑TI'GACG7ITGCCAAAG3-上下游引物扩增gD基因目的片段，预期扩增产物长度为766bp，克隆至DET32a载体．理论上表达一分子量约53kD、N端带有His—t《的融合蛋白。1．6目的基因的克隆以提取的核酸为模板．利

6、用设计好的引物PCR扩增含有HindⅢ、BamHI酶切位点的gD基因。PCR反应条件：94℃5min；94℃lmin．55℃lmin．72℃50s．5个循环：94屯lmin．65qClmin．72℃50s．共30个循环：72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。用限制性内切酶HindⅢ、BarnHl分别对目的基因PCR产物和表达载体质粒DET32a37℃水浴双酶切．用DNA纯化回收试剂盒．纯化回收目的DNA片段。将酶切载体与目的片段用T4DNA连接酶连接。转化DH5“感受态细胞，利用Amp抗性筛选重组转化体。1．7重

7、组质粒的鉴定挑取单个氨苄青霉素抗性转化子，接种含Amp+的LB培养基，培养过夜．用碱裂解法提取质粒。用pet—l和pet一2特异性引物进行万方数据中囚动物检疫2006年第23卷第7期一28PcR扩增．电泳鉴定扩增片段：用HindⅢ、BanlHI双酶切重组质粒，电泳检查插入片段的大小：序列测定由上海生工完成．1．8基因工程重组表达菌的诱导表达及纯化将鉴定后的重组表达质粒转化BL2l(DE31感受态细胞．接种3mL2×YT(Amp+)培养基．37℃振荡过夜后，l：IOO稀释到2×YT(Anlp+)中，37℃振荡培养至对数生长中期f

8、OD萨0．8)，加入终浓度0．05mmol，L的IPTG．分别于诱导前和诱导后1h、2h、4h、6h收集菌液．用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察结果。细菌大量表达后，纯化方法参考胁bondPIlrmcationsvstem试剂盒说明书进行。纯化后的蛋白进行SDs—PAGE电泳和