454测序平台介绍

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1、454测序平台简介核酸生产中心2012年3月E-Learning普及系列课程课程对象：核酸生产中心员工课程目的：帮助授课对象了解454测序平台的大致工作原理学习方式：阅读、自学参考课时：1小时温馨提示：完成本课程的学习有4个条件：1、浏览完所有的页面；2、达到测试分数线；3、浏览完所有的交互页面；4、在学习中途或完成学习后需要退出课程时，请务必点击学习界面右上角的“退出”按钮退出。12课程简介课程大纲1.454测序平台概述2.454文库制备操作流程简介3.454乳化PCR流程简介4.454测序仪操作和数据质控简介5.454的主要项目应用1.1454测序系统概述2005年，

2、454生命技术公司（后被Roche诊断收购）推出基于焦磷酸测序法的高通量测序仪GS20System，此举被认为是第二代测序技术进入商品化应用的开端。从2005年至2011年，Roche/454先后推出了GS20，GSFLX，GSFLXTitanium，GSJunior，GSFLX+等测序仪和试剂版本，数据读长，产能和质量不断上升。目前华大基因所用的454测序仪为2011年中推出的GSFLX+测序平台。1.2GSFLX+测序仪系统表现GXFLX+测序仪测序试剂版本XL+XLR70最大读长可达1000bp可达600bp读长期望700bp450bp数据产出~85%数据量来自读长

3、>500bpread~85%数据量来自读长>300bpread~45%数据量来自读长>700bpread~25%数据量来自读长>500bpread通量700Mb450MbRead产出1MShotgunreads1MShotgunreads运转周期23小时10小时2.0454测序实验流程概述DNA文库制备（4小时）乳化PCR/模板富集（1天）测序（2小时准备，10/23小时上机）2.1454快速DNA文库制备流程末端修复加A接头连接磁珠选择2.1.1雾化法打断基因组DNA如图所示的雾化打断杯，在一个标准大气压（15psi，101.3kPa）氮气雾化打断1分钟，回收打断后DN

4、A并用QIAGEN纯化柱进行纯化。雾化2.1.2DNA的末端修复和加A末端修复加A依赖T4DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性，5’-3’外切酶活性和3’-5’外切酶活性补平DNA片段的末端。依靠T4PNK酶使得被修复末端5’端磷酸化。依靠TaqDNA聚合酶使平末端加A2.1.3接头连接和片段选择接头连接纯化和片段选择经过末端修复和加A步骤后的DNA片段和带有T尾的Y型分子接头连接形成连接产物，连接产物在AmpureXP磁珠和经过特殊处理的盐溶液共同作用下进行纯化，并筛选掉片段大小低于650bp的DNA片段。2.2454快速DNA文库质控依赖固定在454接头上的FAM荧光标

5、记分子，测定文库的荧光强度，并同线性的标准品浓度曲线进行回归分析判定分子浓度。TFAM依靠高灵敏度的Agilent2100DNAHS芯片判定PCR-free的DNA文库片段大小分布，尽可能减少650bp以下的小片段对测序的不利影响。2.3454扩增子文库实验流程蓝色序列：454的A,B测序引物序列红色序列：4碱基的文库key序列用于区分样品和对照序列金色序列：MID（即index）序列，用于区分不同样品绿色序列：研究目标区域（如16SrRNA基因可变区，HLA）上下游的保守序列依照上述图示设计融合引物并对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物使用1.6倍AgencourtA

6、mpureXPbeads纯化，即获得所需的扩增子文库用于后续测序。3.1454乳化PCR实验流程概述乳化反应体系制备（2小时）PCR（9小时）模板磁珠富集（5小时）通过将固定了测序引物的微珠掺入PCR体系，并和矿物油混合并高速震荡，获得“油包水”的乳化PCR反应体系，理想的乳化PCR反应体系中，每个水滴都是一个仅含有一个微珠和一条模板的独立PCR体系，经过50个循环的扩增后，每个微珠都将生成数十万条固定化的单克隆模板，用于后续的富集和测序。3.2通过高速震荡制备乳化PCR体系使用QIAGEN组织匀浆机高速震荡使得水相的PCR体系和矿物油充分混合形成油包水的乳化PCR体系。

7、高倍显微镜下混合完成的乳化PCR体系3.3乳化PCR扩增将乳化的PCR体系等体积分装至96孔板（100μL/孔），在PCR仪上过夜扩增。一般每4个PCR板回收得到的模板珠可满足一个454测序RUN。3.4模板珠的富集空载珠富集磁珠模板珠磁力架使用固定有测序引物的富集磁珠和扩增成功的模板磁珠进行杂交，并通过磁力回收富集磁珠-模板珠混合物，并通过氢氧化钠变性使得回收的模板珠和富集磁珠分离，得到纯度较高的富集珠用于测序。4.1454测序仪的结构试剂区用户界面化学反应和成像区主输液系统4.2454测序芯片的结构454测序芯片上均匀分布