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1、生物技术通报·技术与方法·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2010年第1期454测序法在环境微生物生态研究中的应用12徐晓宇刘和(12江南大学医药学院,无锡214122;江南大学环境与土木工程学院,无锡214122)摘要:传统的Sanger测序技术虽已成熟,但其速度和成本的限制满足不了大规模测序的要求。第二代高通量测序技术结合了乳胶微粒和皮升级反应的454焦磷酸测序法,作为一种高通量测序技术,具有分析结果准确、高速、高灵敏度和高自动化的特点。对454测序法的技术原理和操作步骤进行了介绍,对近年来运用该方法在环
2、境微生物生态研究领域的进展进行了综述。关键词:454测序环境微生物生态宏基因组Applicationof454SequencinginEnvironmentalMicrobialEcology12XuXiaoyuLiuHe12(SchoolofMedicineandPharmaceutical,Wuxi214122;SchoolofEnvironmentandCivilEngineeringJiangnanUniversity,Wuxi214122)Abstract:Therehasbeenadesiretoincre
3、asethethroughputofDNAsequencingeversinceSangersequencingbychaintermina2tionorfragmentationtechniquescoupledwithelectrophoreticsizeseparation1454sequencingisthepyrosequencingwhichcombinedwithmicrofluidicsandpicoliterreaction1Inthisarticle,thedevelopmentofthe454se
4、quencingsystemwasdiscussed,andtheapplicationof454sequencinginenvironmentalmicrobialecologywasreviewed1Keywords:454sequencingEnvironmentalmicrobialecologyMetagenomics自Sanger测序法1977年问世以来,因其准确、作一简要综述。读长较长的优点而被广泛应用,但是这种测序方法1454测序法的原理效率较低,科学的发展需要更高通量的测序平台,包111焦磷酸测序法的
5、原理括454测序技术在内的新的测序方法应运而生。454测序法的基础是焦磷酸测序技术,它的原454测序法是以DNA扩增的乳胶系统(emulsion理是将PCR扩增的单链与引物杂交,并与DNA聚system)和皮升(picoliltre)大小焦磷酸(pyrophos2合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸[1]phate)为基础的测序方法。据发明者称,该方法酶、底物荧光素酶和5′磷酸硫腺苷共同孵育,然后比传统的Sanger测序法要快100倍,而每个碱基的脱氧核糖核苷三磷酸即按照碱基配对的原则依次连测序成本仅为后者
6、的几十分之一。454公司以该法接到引物上。在每一轮测序反应中,只加入一种为基础推出了高通量测序平台—GenomeSequencerdNTP,若该dNTP与待测模板配对,DNA聚合酶可20,该公司于2007年被罗氏诊断公司收购,进而推以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸出第二代测序平台—GenomeSequencerFLX(GS基团(PPi)。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催[2]FLX),后者在技术的成熟性和性能方面的表现均化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光远远超越了第一代产品。这种高通量低成
7、本的测序素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化,氧化荧光素方法为环境微生物生态研究提供了新的手段,本文发出与ATP量成正比的可见光信号。ATP和未掺对454测序技术在环境微生物生态学研究中的应用收稿日期:2009209230基金项目:江苏省科技支撑计划社会发展项目(BE2008627)作者简介:徐晓宇,女,硕士,研究方向:环境微生物;E2mail:iist@jiangnan1edu1cn74生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第1期入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信24
8、54测序法在环境微生物生态学研究中号,并再生反应体系,然后加入下一种dNTP,如此循的应用[3]环(图1)。与传统的Sanger测序方法相比,454测序技术无需文库构建,没有克隆的误差。该技术环境微生物生态学研究中包括土壤、海洋、污泥和废水等。211454测序法在土壤微生物研究中的应用土壤微生物对自然界物质的转化和循环起着极为重要
