《组织细胞培养技术》ppt课件

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1、组织细胞培养技术授课教师左丽贵阳医学院免疫学教研室2008年4月10日第三章培养用液培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液、常用试剂及培养基三大类，培养基又分为天然培养基与合成培养基.平衡盐溶液（balancedsaltsolution，BSS）具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用，并可供细胞生存所需的能量和无机离子成分，另外尚可用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。常用试剂是制备细胞、培养细胞及检查细胞所必需的，为细胞培养提供了方便

2、、有利的条件。水不仅是细胞的主要成分，也是细胞赖以生存的主要环境，营养物质、代谢产物都必须溶解在水中，才能被细胞吸收和排泄。体外培养细胞对水的质量非常敏感，要求很高。水的纯度不够,即使有害元素含量极少对细胞也会产生不利的影响，有时引起细胞中毒死亡。因此配制所有的培养液和各种溶液应使用纯化水。组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水。二次蒸馏水或一次蒸馏水可用以清洗器皿或配制一般洗液。离子交换水装置此装置用离子交换树脂可有效地去除离子，所制得的水称为去离子水。制取去离子水不用燃料、成本低、水质好、操作

3、简便，但不能去除非离子物质或有机物质，因此组织培养中很少使用，仅用于冲洗玻璃器皿等。二、蒸馏水装置玻璃蒸馏器制取的蒸馏水符合组织培养的要求，因用金属蒸馏器不能完全排除金属离子，故不符合要求。有时为制取大量高质纯化水，可用去离子水经玻璃蒸馏器重蒸,组织培养用液需用三蒸水配制。蒸馏水一般是现用现制，存放时间不宜太长，最好不要超过两周。因空气中的杂质和有毒气体能污染水质，CO2也会溶解于水，故存放时要将蒸馏水装满贮存容器，密封瓶口防止空气混入。第二节平衡盐溶液平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成，

4、其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。BSS内还含有少量的酚红，作为pH变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄色，变碱性时呈紫红色，中性时呈桃红色。目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下：（1）作为配制培养基的基础溶液：（2）配制各种试液：如配“胰酶”消化液。（3）用于洗涤组织和细胞。配制要求:（l）要防止钙的沉淀：

5、应将其中的CaC12单独配制，并将平衡盐溶液配成浓缩液，使其在稀释前不让Ca++与PO42-和CO32-接触，以免产生不溶解的CaPO4和CaCO3。避免产生CaCO3的方法是将Na2CO3单独配制，使用时现加。（2）要有良好的缓冲作用：Hanks液和Earle液都需一定量的CO2平衡。因此应将瓶盖（橡皮塞）盖紧，以防瓶中CO2逃逸，使溶液pH增高。pH调整液单独灭菌时，亦应将瓶盖塞紧，否则NaHCO3受热分解为NaOH和CO2，失去其调节pH之功能。为了便于保存和减少有关成分的化学反应，此液可配成2

6、0x、10x和5x浓缩液的储存液（母液）。10x母液配制法甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂NaC180.0gKCl4.0gMgSO47H2O2.0gCaC121.4g(2H2O1.85g)待完全溶解后，补足三蒸水至500ml。乙液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂Na2HPO40.6g（12H2O1.52g）KH2PO40.6g葡萄糖10.0g0.4％酚红50.0ml2．Hanks使用液配制法取甲、乙液等量用三蒸水稀释10倍，即成使用液，用前高压灭菌。例如配制100mlHank使用液，则取三

7、蒸水900ml、甲液50ml、乙液50ml混匀，用110℃高压灭菌10min。临用时，用7.5％NaHCO3调至所需pH。附：为配制上述Hanks液，应先配好0.4％酚红溶液待用。2．Hanks使用液配制法取上述甲、乙液等量用三蒸水稀释10倍，即成使用液。用前高压灭菌。例如配制100mlHank使用液，则取三蒸水900ml加入甲液50ml、乙液50ml混匀，用高压灭菌15min。临用时，用7.5％NaHCO3调至所需pH。附：为配制上述Hanks液，应先配好0.4％酚红溶液待用。配制方法如下：称取0.

8、4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐渐加入0.1mol/LNaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加NaOH的量，共加至11.28ml为止，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72ml，高压灭菌15min。第三节细胞培养常用试剂细胞培养常用试剂主要包括分离组织和分散细胞用的细胞分离液（消化液）、调整培养液酸碱度的pH调整液、防止培养过程中发生污染的抗生素溶液、指示酸碱度（pH）的酚红溶液、检查细胞和观察研究细胞用的各种染液等。一、细胞分离液（消化液）常用的