常见的生化与分子生物学技术

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1、常见的生化与分子生物学技术生物大分子的提取和纯化电泳技术PCR技术核酸序列的测定蛋白质相互作用AgrosePAGE双向电泳杂交技术酶联免疫技术层析技术、超滤技术、膜技术检测和纯化分离生命现象生化组分分析1、结构与性质2、功能3、代谢及其细胞调控改造利用生物化学研究技术方法经典的研究步骤：分离生化组分（细胞器和生物分子）；分析生化组分的结构；分析生化组分的功能和代谢（合成与分解）及其相互作用。2021/7/193生物化学研究技术方法生物化学研究技术：分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心、层析、电泳等；分析检测技术：电泳、层析、光谱、

2、质谱、电化学技术、分子标记等。分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。2021/7/194生物大分子分离纯化的一般步骤和原则层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）生物组织→→提取液→→粗产品→→结晶分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力依据原理要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：在水和各种有机溶剂中的溶解性。在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳

3、定性。固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。对其他生物分子的特殊亲和力。分离纯化的一般程序1、材料的选择和预处理2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。生物大分子的浓缩沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少

4、量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等。吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。透析浓缩法减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。冰冻干燥法纯度鉴定生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS

5、-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。蛋白质、核酸的定性定量检测1、蛋白质的测定凯氏定氮法（含N量6.25）双缩脲法、Folin-酚法紫外光度法（max=280nm）离心法、电泳法、层析法2、酶活力的测定终点法、动力学法3、氨基酸的测定茚三酮法Sangerf法、Edmam法、DNS法4、核酸的测定紫外

6、光度法（max=260nm）分子杂交法离心法、电泳法核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。电泳基本原理电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分

7、析和鉴定的基本原理。电泳带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。影响泳

8、动度的因素：1.电场强度：电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。2.溶液pH为使电泳时pH值恒定，必