常见的生化与分子生物学技术大串讲

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1、常见的生化与分子生物学技术电泳电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下，向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然，带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定或纯化。电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶）为支持物的凝胶电泳。等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯

2、酰胺凝胶电泳、二维电泳、脉冲场凝胶电泳。电泳法分离三种不同的氨基酸透析和超滤透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子溶液中的小分子物质。超滤对透析原理进行了改进，它利用具有一定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液的目的。透析方法示意图超滤方法示意图沉淀与离心沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中

3、沉淀出来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。实现选择性沉淀的方法有改变pH或改变离子强度或者加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作用下通过溶液发生沉降。差速离心和密度梯度离心层析层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相，如水和各种溶剂。当待分离

4、样品随着流动相通过固定相时，各组份在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组份会不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到分离各组份的目的。表1主要的层析方法及其原理名称分离原理吸附层析各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同分配层析各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同离子交换层析固定相是离子交换树脂

5、，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的亲和力不同凝胶层析固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞的程度不同疏水层析固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂的结合能力不同亲和层析固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组份分离的目的离子交换树脂分离氨基酸分子筛示意图亲和层析示意图蛋白质研究方法假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X1.如何得到这种蛋白质?蛋白质的分离、纯化技术2.这种蛋白质的大小？（SDS-PAGE）3.它的pI是多少？（等电聚焦）4.其他细胞或其他生物体内是否存在？（Western印迹）5.其一级结构如何？（序列

6、分析）6.其三维结构又如何？X-射线衍射和核磁共振蛋白质纯化一、准备工作：要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。二、纯化步骤：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定蛋白质和酶纯化的常见方法和方案设计分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水性、与特定配体结合的性质等。常用的方法有：沉淀（溶解性）；离子交换（电荷）；聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏水作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的

7、特异性结合）。蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般经过四个阶段：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（4）鉴定，包括纯度、大小或pI的测定。蛋白质纯度的鉴定（1）电泳法：如聚丙烯酰胺凝