《基因诊断》PPT课件

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1、第九章基因诊断第一节基因诊断的概念及常用技术基因诊断—利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。一、基本概念二、基因诊断常用方法㈠核酸分子杂交㈡PCR㈢DNA序列测定㈣DNA芯片技术(一)核酸杂交基本原理-------核酸变性和复性理论即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。probeprobe核酸杂交

2、的关键要素probeDNAtargetDNAsignaldetection核酸杂交方法分类按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。固相杂交分类Southern印记杂交Northern印记杂交斑点杂交原位杂交Southernblot是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。Northern杂交用于RNA

3、的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。斑点杂交（Dotblot）可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。原位杂交（Colonyinsituhybridization）可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。（二）利用PCR及结合其他技

4、术进行基因诊断直接采用PCR进行基因诊断采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断*通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊断采用PCR技术对靶核酸进行定量分析寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交（ASO）#（三）DNA序列测定DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。（四）DNA芯片技术

5、应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。二基因诊断的特点高特异性高灵敏度获得稳定的结果早期快速适用性强，应用范围广第二节遗传病的基因诊断一、概述人类的遗传病达数千种地中海贫血在意大利等国家发病率达10％镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。二、镰状细胞贫血血红蛋白病（异常血红蛋白病）红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。患者多在成年以前死亡×MstⅡ

6、酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb（一）镰状红细胞贫血分子机制567--ProGluGlu—--CCTGAGGAG--567--ProAlaGlu—--CCTGTGGAG--（二）镰状细胞贫血的基因诊断方法限制性内切酶/Southernblot采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电泳→转膜→32P标记的β珠蛋白cDNA杂交→放射自显影+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析PCR/限制性内切酶设计引物

7、→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶切→电泳→EB染色→直接观察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-3’扩增产物294bp镰状细胞贫血的基因诊断方法引物1CCTGAGGAGCCTGTGGAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位点(CCTNAGG)+﹣103bp191bp294bp正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析RT-PCR/序列分析采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序

8、→推测氨基酸序列→进行诊断镰状细胞贫血的基因诊断方法二、β－地中海贫血(β－Thalassaemia,简写βthal或βT)β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少（β＋）或完全缺失（β0）β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率