基因诊断教学ppt课件

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1、基因诊断Genediagnosis李雅楠疾病产生原因：基因变异+环境因子（1）内源基因变异基因结构突变基因表达异常（2）外源基因入侵基因诊断(genediagnosis)：利用分子生物学技术，检测基因结构(DNA)及其表达(RNA)是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。第一节基因诊断的概念DNA：主要，分析序列RNA：定量分析mRNA1针对性强，特异性高第二节基因诊断的特点基因异常疾病病因诊断检测致病基因分子杂交：放射性同位素、酶、化学发光试剂标记探针PCR：循环扩增至百万倍再分析致病基因2灵敏度高核酸特别是DNA比蛋白质稳定，样品要求不高3易获得稳定的结果

2、4快速、早期诊断数小时即可疾病发病前遗传病感染性疾病癌症法医学5应用范围广、适用性强一核酸分子杂交二聚合酶链反应（PCR）技术三DNA序列测定第三节基因诊断的技术基础核酸分子杂交单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。主要依据：碱基互补、变性、复性一核酸分子杂交DNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC1斑点杂交变性DNA或RNA点到固相支持滤膜上→用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号

3、→分析结果。简便、快速、灵敏、样本用量少；特异性不高，有一定比例的假阳性。检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。3Northern印迹技术提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。检测组织细胞中总RNA或mRNA2Southern印迹技术3原位杂交4DNA芯片多种特定寡核苷酸探针有规律地排列固定于支持物与许多种待测基因(已标记荧光素)杂交激光共聚焦荧光检测系统扫描芯片计算机系统分析二PCR技术1直接采用PCR技术进行基因诊断2PCR技术联合其他基因分析方法三DNA序列测定

4、分离出病变基因，测定碱基排列顺序最确切、最直接的基因诊断方法Sanger双脱氧链终止法生物技术公司完成一.等位基因特异寡核苷酸探针杂交法allelespecificoligonucleotide,ASO第四节基因诊断的基本方法等位基因：位于一对染色体相同位点控制同一性状的一对基因。点杂交技术检测等位基因突变情况(遗传病)设计和制备涵盖突变位点的一对正常寡核苷酸探针和突变寡核苷酸探针病人的DNA样品一分为二，分别吸附于杂交膜上利用正常探针和突变探针分别进行探针杂交作出诊断。原理正常探针突变探针正常者杂合子纯合子正常者杂合子纯合子正常探针（+）（+）（-）突变

5、探针（-）（+）（+）β地中海贫血CD17点突变的ASO分子杂交二限制性核酸内切酶酶谱分析法来自细菌的限制性核酸内切酶有几千种。每一种限制性核酸内切酶识别特定的DNA序列(限制性识别位点)，并在其中的某一特定碱基位点将DNA切断DNA突变对酶切位点的影响：1)若突变发生在限制性识别位点内，可丧失相应的酶切位点2)若突变发生在限制性识别位点外，可产生新的酶切位点。利用限制性核酸内切酶的酶切图谱可检测DNA样本中是否存在基因突变。电泳分析诊断原理基因突变限制性内切酶识别位点改变(丧失或增加)经限制性内切酶酶切限制性片段长度或数量改变常用方法早期：限制性酶切凝胶

6、电泳Southern印迹探针杂交显示目前：PCR扩增限制性酶切凝胶电泳荧光染色显示举例：——镰刀状红细胞贫血β－珠蛋白基因的第六个密码子A→T↓表达产物：谷氨酸→缬氨酸一个碱基突变→缺失1个MstⅡ内切酶位点正常人：1.1kb患者：1.3kb5’3’5’3’1.1kb1.3kbMstII酶切位点（CCTNATG）正常基因突变基因1.3kb1.1kb0.2kb1231、正常人2、突变携带者3、患者三DNA限制性片段长度多态性分析restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP（1）单核苷酸变异（SNP）发生在基因组中的单个

7、核苷酸的变异发生：人类基因组平均200~500bp可发生一次单核苷酸变异。后果：坏、好、无影响，后者称为中性突变，并按照孟德尔规律遗传。多态性：个体间出现的基因组差异性，主要由中性突变所致。（2）RFLP概念若突变(多为中性突变)导致某一限制性核酸内切酶识别位点改变(获得或丢失——遗传标记)，经酶切后，出现DNA片段长度的差异，在人群中形成两种或两种以上的限制性类型，并按孟德尔规律遗传，称为限制性片段长度多态性。（3）连锁分析(linkageanalysis)利用与致病基因相邻的某些基因或序列，作为遗传标志，通过鉴定遗传标志的存在而判断个体是否带有致病基因

8、。用于检测致病基因结构不清楚或基因突变复杂的遗传性疾病。属于间接诊