修饰动物模型的建立及应用

《修饰动物模型的建立及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication生物科学与技术学院第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)一、分子杂交与印迹技术的原理复性RNADNA核酸分子杂交的原理带有某种标记的核酸单链作为探针，在一定条件下，按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体，鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分

2、析。核酸分子杂交的杂交动力学核酸分子杂交核心序列形成自发过程（一）印迹技术（二）探针技术探针(probe)探针的来源基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)（二）RNA印迹技术(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)核酸杂交技术（一）SouthernBlot原理用途：检测

3、样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。SouthernBlot操作步骤：DNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色斑点印迹杂交(Dotblot)斑点印迹优点-----简单、迅速；核酸粗提、多样品检测缺点-----不确定分子量、特异性不高，假阳性原位杂交（InSituhybridization）标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。1969,Pardue--爪蟾核糖体基因探针1970,Orth---兔乳头状瘤病毒cDNA探针WesternBlot原理操作过程SDS-PAGE电泳转膜（P

4、VDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影Hours04816WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3/Bcl-2.Cellsweretreatedwith20Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol.注意

5、的问题蛋白质电泳常用SDS-PAGE非变性PAGETris-Tricine胶中电泳聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套三种印迹技术的比较分子杂交实验①②③目录放射自显影照片目录DNA芯片:（Bio-chip、DNAarrays、Oligonucleotidemicrochip)特点：高度并行性，多样性，微型化和自动化。DNA芯片AssayFormatsNormalSample1.ExtractgenomicDNAfromtissue4.HybridizetoChip5.WashandImage2.LabelGenomicExpression1.Extrac

6、tmRNAfromtissue2.ProducecDNAbyRT&Label4.HybridizetoChip5.WashandImage3.MixwithlabeledreferenceDNA3.MixwithlabeledreferencecDNATumorSampleDNAmicrarrayrobotenclosedinatemperatureandhumiditycontrolledenvironment.ResearchUse——FromSequencetofunction计算Ratio值(=Cy3/Cy5)在0.5-2.0之外的定义为在两样本中

7、有明显差异表达。进而获取初步功能信息。Clustering芯片杂交结果示意图DNA点阵目录DNA芯片技术的主要应用①分析基因组、发现新基因②基因表达的研究③DNA序列分析④基因诊断⑤基因药物设计第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReactionPCR技术发展简史(1)PCR的最早设想(2)PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。(3)PCR的改进与完善耐热的DNA聚合酶TaqDNA聚合酶于1988年saiki从嗜热水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分离出来

8、。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中