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时间:2019-06-25
《实验一 植物体内游离脯氨酸含量的测定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定一、目的在逆境条件下(旱、热、冷、冻),植物体内脯氨酸的含量显著增加,植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低冰点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应,当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加
2、热处理后,茚三酮与脯氨酸反应,生成稳定的红色化合物,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度,即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。三、材料、仪器及试剂1.材料:植物叶片。2.仪器:分光光度计;电子分析天平;离心机;小烧杯;普通试管;移液管;注射器;恒温水浴锅;漏斗;漏斗架;滤纸;剪刀;洗耳球。3.试剂及配制:2.5﹪酸性茚三酮溶液配制:将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L-1磷酸中,搅拌加热(70℃)溶解,贮于冰箱中。3%磺基水杨酸配配制:3g磺基水杨酸加
3、蒸馏水溶解后定容至100ml。10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制:精确称取20mg脯氨酸,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解,再倒入200ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度(为100μg·ml-1脯氨酸母液),再吸取该溶液10ml,加蒸馏水稀释定容至100ml,即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。冰醋酸;甲苯。四、实验步骤1. 脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支试管,编号,按下表配制每管含量为0~12μg的脯氨酸标准液。加入表中试剂后,置于沸水浴中加热30min。取出冷却,各试管再加入4ml甲苯,振荡30秒钟,静置片刻,使色素全部转
4、至甲苯溶液。试剂管号01234510μg·ml-1脯氨酸标准液(ml)蒸馏水(ml)冰醋酸(ml)2.5﹪酸性茚三酮(ml)02220.21.8220.41.6220.61.4220.81.2221.01.022每管脯氨酸含量(μg)02468101.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,在520mm波长处测定吸光度(A)值。1.3标准曲线的绘制以1~5号管脯氨酸含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。2.样品的测定2.1脯氨酸的提取称取不同处理的植物叶片各0.5g,分别置大试管中,然后向各管
5、分别加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动),冷却后过滤于干净的试管中,滤液即为脯氨酸的提取液。2.2测定吸取2ml提取液于带玻塞试管中,加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂,在沸水浴中加热30min,溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯,摇荡30秒钟,静置片刻,取上层液至10ml离心管中,在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯溶液为空白对照,在520mm波长处测定吸光度(A)值。五、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量,按下
6、公式计算样品中脯氨酸含量:X×提取液总量(ml)脯氨酸含量(μg·g-1Fw)=———————————————————样品鲜重(g)×测定时提取液用量(ml)公式中:X-从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg)五、注意事项:1.配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定,因此最好现用现配。2.测定样品若进行过渗透胁迫处理,结果会更显著。3.试剂添加次序不能出错。
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