盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响

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1、盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响一、实验目的：1、学习脯氨酸含量测定方法；2、研究盐胁迫等逆境对植物体内脯氨酸含量的影响。二、实验原理：胁迫条件下植物体内脯氨酸大量积累，而且胁迫时间越长,积累的脯氨酸越多；因此植物体内的脯氨酸含量在一定程度上反映了植物受胁迫影响的程度，可作为植物对逆境响应的一个参考指标。在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应，生成红色化合物，此产物在520nm波长下具有最大吸收峰，可用分光光度计测定，此法具有专一性。在pH1-7时用人造沸石可以除去一些干扰的氨基酸。三、仪器与试剂：1、实验试剂：3%磺基水杨酸，甲苯，冰醋酸，人造沸石，酸性茚三酮试剂（25g

2、茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml6mol/L磷酸中,加热（70℃）溶解。常温保存期24h，冰箱中保存48h），标准脯氨酸溶液（10mg脯氨酸溶于100ml80％乙醇中，浓度为100ug/ml）。2、实验仪器：天平，研钵，移液管，水浴锅，离心机，试管，722型分光光度计四、实验步骤：1、准备实验材料提前一周培养小麦材料并根据实验目的对其分组处理，以备后用。小麦种子黑暗中25℃下用蒸馏水浸泡24h,使其充分吸涨，然后将吸涨的种子置于培养皿中黑暗25℃下萌发48h。将萌发一致的种子播种于培养皿中,用1/2的Hoagland营养液培养.材料在第一片新叶完全展开后分为两组，第一组

3、作为对照,继续浇灌1/2Hoagland溶液；第二组为NaCl处理组，浇灌含0.8%NaCl的1/2Hoagland溶液;继续培养三天后，取地上部分以备实验用。2、制作标准曲线100ug/ml脯氨酸配置成0、0.5、1.0、5、10、20μg/ml一系列浓度的标准溶液。取标准溶液各2ml，加入2ml3%磺基水杨酸、１ml冰醋酸和3ml茚三酮试剂于加塞试管中，充分混匀后在沸水浴中加热显色40min，冷却后加入４ml甲苯盖好盖子充分震荡，待其静置分层后，吸取红色甲苯相，于波长520nm测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。3、NaCl胁迫

4、对小麦脯氨酸含量的影响分别取对照和NaCl处理的小麦幼苗的地上部分（芽鞘和叶子）0.3g，用3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10分钟，加入0.5g人造沸石充分震荡，冷却后转移至离心管中，3000r/min离心10min，取上清液待测。各取对照和NaCl处理的提取上清液2ml，分别加入2ml蒸馏水，１ml冰醋酸和3ml2.5%酸性茚三酮试剂，与上述制作标准曲线一样进行显色，萃取和比色，最后从标准曲线中查得脯氨酸含量。按照公式计算,植物体内脯氨酸含量（ug/g）=4A×2.5/0.3,其中Ａ为查表所得的脯氨酸。五、注意事项：•配置的酸性茚三酮溶液仅

5、在24h内稳定，因此最好现用现配；•提取、反应要充分；•离心前必须平衡；•甲苯有毒，需格外小心。六、实验结果：如上表所示：脯氨酸标准曲线为：y=0.0774x+0.003测得实验组和对照组小麦幼苗地上部分的吸光值分别为：0.606和0.242.因此：实验组：当y=0.606时，A=x=7.79ug/ml脯氨酸含量=4A×2.5/0.3=259.67ug/g对照组：当y=0.242时，A=x=3.09ug/ml脯氨酸含量=4A×2.5/0.3=103ug/g七、实验分析由实验结果可知实验组（经盐胁迫的小麦）的脯氨酸含量明显多于对照组（未经盐胁迫的小麦）的脯氨酸含量，说明小麦

6、受到了盐胁迫的影响，胁迫条件下小麦体内脯氨酸大量积累，体内的脯氨酸含量在一定程度上反映了小麦受胁迫影响的程度，可作为小麦对逆境响应的一个参考指标，从结果可以看出，受胁迫小麦体内的脯氨酸含量较高。通过本次实验，也学会了脯氨酸含量测定方法，所以还是很有收获的。