植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定.doc

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1、植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit），在PH1~7范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等2—氨基的氨基酸）。3．酸性茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮，加入60mL冰醋酸和40mL6mol/L磷酸，于70℃加热溶解，冷却后

2、储于棕色试剂瓶中，4℃保存，两天内稳定。4．脯氨酸标准母液：称取10mg脯氨酸溶于少量80%乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL,成100μg/L母液。测脯氨酸含量：1．脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0,0.5,1.25,2.5,5.0,7.5,10.0,15.0mL分别放入8个50mL容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL，配成0.0，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0μg/mL的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液2mL，冰醋酸2mL，茚三酮试剂2mL，加入到10mL带塞刻度试管中，塞上塞子，

3、于沸水浴中加热15分钟，用分光光度计测定520nm的光密度值，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。2.测定样品的脯氨酸含量（1）提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份0.3g。剪碎，加入适量80%乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至25mL刻度试管中，用80%乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80%乙醇定容至刻度，混匀，80℃水浴中提取20分钟。(2）除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g的人造沸石和0.2g活性碳，强烈振荡5分钟，过滤

4、，滤液备用。（3）脯氨酸含量的测定：分别吸取上述提取液2mL于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2mL80%乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂，沸水浴中加热15分钟，冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。样品中脯氨酸含量的计算:脯氨酸含量(μg/g)=(cxv/a)/w或脯氨酸含量(%)=[(c*v)/a]/w*106×100其中，C：由标准曲线上查得的脯氨酸微克数；v：提取液总体积（mL）a：测定液体积（mL）w：样品重（g）