丹酚酸A体内外代谢分析

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1、摘要本论文旨在通过一系列体内外手段，系统研究丹酚酸A的代谢特征，考察其II相结合代谢的种属差异，阐明其甲基-葡萄糖醛酸级联结合代谢机制，以及不同给药途径的体内代谢一致性，并与母体化合物对照，评价其甲基结合代谢物的抗血小板聚集活性。实验方法如下：建立SAA与不同种属动物（人和大鼠）肝细胞亚组分体外共孵育II相结合代谢体系，利用代谢产物生成速率或底物清除速率计算酶促代谢动力学参数，通过代谢产物谱和酶促动力学参数对SAA体外II相结合代谢的种属差异进行定性和定量表征。根据不同孵育条件下级联代谢物生成速率，计算S

2、AA的II相级联结合代谢的酶促动力学参数，并与体内代谢产物谱进行比较，揭示SAA体内级联代谢途径及其机制。以健康大鼠为实验对象，考察SAA经口服和静脉注射两种不同途径给药在代谢产物谱上的一致性；进一步通过与同时口服给予COMT酶抑制剂药物恩它卡朋和/或UGTs酶竞争剂布洛芬组动物血浆中原形药物暴露水平的比较，阐明SAA经口服途径给药的体内代谢机制，以及与静脉注射给药途径的一致性。利用体外制备的大鼠贫血小板和富血小板样本，以阳性药物阿司匹林和母体化合物SAA为对照，根据抗血小板聚集活性的IC50值测定结果，

3、对化学结构明确的四种主要的SAA体内甲基结合代谢物抗血小板聚集活性进行定量评价和比较。实验结果：体外温孵甲基结合代谢的酶促反应动力学研究结果显示，SAA的甲基结合代谢在代谢产物类别上不存在明显的种属差异，但受实验用人源肝S9的COMT酶活力偏低的影响，在人源肝S9共孵育体系中仅观察到两个单甲基结合产物与鼠肝S9共孵育体系一致，另两个二甲基结合代谢物不明显。这一实验结果也进一步提示，SAA分子结构中4个间位酚羟基在体内COMT酶的介导下，经逐级甲基结合代谢过程生成一系列单甲基、二甲基及三甲基结合代谢产物。S

4、AA在人和鼠源肝-1-1S9体系中体外甲基结合代谢的米氏常数Km分别为0.105mmolL、0.51mmolL，I万方数据-1-1-1-1最大反应速率Vmax分别为0.096nmolmgmin、6.52nmolmgmin，表明SAA的甲基结合代谢在底物与代谢酶的亲和力以及代谢速度上也存在明显的种属差异。人肝S9中COMT酶对SAA的亲和力高于鼠源肝S9，但甲基结合代谢的速率显著偏低，可能与实验用人肝S9体系中的较低的蛋白浓度和COMT酶活力有关。体外温孵葡萄糖醛酸结合代谢的酶促反应动力学研究结

5、果显示，SAA的葡萄糖醛酸结合代谢在代谢产物类别上不存在明显的动物种属差异。SAA在HLM和RLM-1体系中体外酶促葡萄糖醛酸结合代谢反应的米氏常数Km分别为0.037mmolL、-1-1-1-1-10.585mmolL，最大反应速率Vmax为0.065nmolmgmin、2.08nmolmgmin，表明SAA的葡萄糖醛酸结合代谢在底物与代谢酶的亲和力以及代谢速度上均存在明显的种属差异。HLM中UGTs酶对SAA的亲和力高于RLM，但其葡萄糖醛酸结合代谢的速率显著偏低，可能与实验用人肝微粒体体

6、系中较低的蛋白浓度和UGTs酶活力有关。体外温孵级联代谢研究结果显示，SAA先发生葡萄糖醛酸结合后的甲基结合代-1-1-1谢的Km和Vmax分别为0.026mmolL、3.18nmolmgmin；SAA先发生甲基结合-1-1-1后的葡萄糖醛酸结合代谢的Km和Vmax分别为0.015mmolL、1.34nmolmgmin，通过酶促动力学参数的比较可知，SAA在体内经过一种结合代谢之后更容易进行另一种结合代谢，但是受化合物位阻的影响反应速度有所下降。通过SAA体外两种级联代谢的色谱图与体内胆汁样品

7、的对比发现，两种代谢顺序的孵育体系中均有级联代谢产物的生成，但是，体内胆汁中主要的级联产物在先甲基后葡萄糖醛酸结合的体系中都可以找到，推测SAA在体内先甲基后葡萄糖醛酸结合的反应易于发生。体内药代动力学实验结果显示：同时口服给予COMT酶抑制剂药物恩它卡朋和/或UGTs酶竞争剂布洛芬组动物血浆中SAA的AUC均比对照组高，说明加入COMT酶抑制剂和/或UGTs酶竞争剂之后确实在一定程度上抑制了SAA的代谢清除，提高了SAA在血浆中原型的浓度，同时验证了SAA口服给药代谢途径同样存在SAA的甲基结合、葡萄糖

8、醛酸结合代谢。大鼠体外抗血小板聚集实验结果显示，SAA及其甲基化结合产物的抗血小板聚-1-1-1集活性的IC50值分别为3.52mmolL、3.34mmolL（M1）、5.07mmolL（M2）、-1-18.06mmolL（M3）和5.90mmolL（M4），阳性对照药阿司匹林的IC50值为2.53-1mmolL，通过数据比较可知，SAA甲基结合代谢产物的抗血小板活性均不如阿司II万方数据匹林，但是并不存在数量级的