丹酚酸A甲基结合代谢物的制备与结构鉴定.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第1期2014年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry65～70DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．30431丹酚酸A甲基结合代谢物的制备与结构鉴定许卉李艳丽田红翠翟文婷(烟台大学药学院，烟台264005)摘要利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A(SAA)的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SA

2、A后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇一水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95％以上的代谢产物单体成分。综合应用ESI．MS、MS，以及HNMR，”CNMR，HSQC和HM．Bc等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3．甲氧基丹酚酸A(1)、3一甲氧基丹酚酸A(2)、3，3"-二甲氧基丹酚酸A(3)和3，3"-二甲氧基丹酚酸A(4)。关键词丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱1引言化合物在体内吸收、分布

3、、代谢和排泄的过程(Absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注。丹酚酸A(SalvianolicacidA，SAA)是丹参SalviamihiorrhizaBge．中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成(图1)，是丹参活血化瘀的

4、主要功效成分J，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段I6J。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、c环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化，这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶(Catechol一0．methyl—transferase，COMT)和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(Uridine—diphosphateglucuronosyhrans

5、ferases，UGTs)代谢，生成包括葡醛酸和／或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础卜mj。生物基质中的代谢产物不仅种类多，而且含量低(mg／L及以下水平)，目前文献报道的SAA代谢物结构均是基于LC—MS分析的推测结果，不能给出如异构体在具体结合位置上的差O异等明确的化学结构信息，从而难以揭示其在体内H的真实代谢途径，以及代谢产物的生物活性与化学R1H结构问的关系。本研究在前期工作¨基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体SAA：R1

6、=R2=R3=一H系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一1：Rl=一CH3，R2=R3=一H；2：R2=一CH3，RI=R3=一H致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁3：R1=R3=一CH3，R2=一H；4：R2=R3=一CHs，Rl=一H共振波谱方法阐明了其化学结构特征(图1)。相关图1SAA及代谢物1—4的化学结构研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活Fig．1ChemicalstructuresofsalvianollicacidA(SAA)性代谢产物的新药筛选和发现提供

7、基础。anditsmethylatedmetabolites1-42013-05-09收稿；2013-0822接收本文系国家自然科学基金(No．81102780)资助项目E—mail：ytu309a@163．corn分析化学第42卷2实验部分2．1仪器与试剂Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Ther-moTSQQuantumAccess三重四级杆串联质谱仪(美国ThermoFisherScientificInc．)，包括电喷雾离子化接

8、VI和Xcalibur色谱工作站，与Agilent1100高效液相色谱仪构成HPLC—MS联用分析系统；BrukerAvance400核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)。丹酚酸A(纯度98．6％，山东靶点药物研究有限公司)；s一腺苷甲硫氨酸(SAM，纯度1>98％，陕西森弗生物技术有限公司)；乙腈、甲酸水(HPLC级，FLU—KA公司)；ODS(YMC—AA12S50，50m，日本)。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。2．