PCR技术及其在动物科学领域的运用

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1、PCR技术及其在动物科学领域中的运用摘要：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。近年来，PCR技术迅速发展并与其他技术结合衍生出了荧光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列新技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物学、医学、免疫学等领域。本文通过介绍PCR技术及其在动物科学领域中的运用，使读者对PCR技术有初步的了解并对其运用领域有概况性的认识，更是为了今后的科学研究积累了更多的知识和提供了技术上的支持。关键词：荧光定量PC

2、RRT-PCR探针引物（一）PCR技术简介及其运用概述　　聚合酶链式反应（英文全称：PolymeraseChainReaction），简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。1、PCR技术原理双链DNA在多种酶的作用下

3、可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝，在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。2、PCR工作原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增

4、形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3、PCR种类

5、及运用（1）、RT-PCR原理：首先提起RNA，然后用逆转录酶与MRNA为模板进行CDNA第一链的合成，其原理同PCR.。RT-PCR是个半定量的试验，可以确定在MRNA水平的表达差异，即在转录水平。（2）、免疫PCR(immunopolymerasechainreaction,IPCR)原理：是用一段已知DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,根据特异性PCR产物的有无来判断待测抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法,理论上可以检测单个抗原分子,但实践中它的敏感性受许多因素的影

6、响,如连接分子、显示系统的选择、DNA报告分子的浓度、PCR循环次数等。由于PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比,因此免疫PCR还可用于抗原的半定量试验。（3）、巢式PCR原理：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增.巢式PCR比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA。（4）、实时荧光PCR原理：利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定其实DNA拷贝数。实时PCR，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增

7、幅量为基础进行DNA的定量分析。实时PCR的定量使用荧光色素，目前有二种方法，一种是在dsDNA中插入特异的荧光色素，例如SYBRGreen荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBRGreen荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBRGreen与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基