实时荧光定量PCR简介及其在食品监测领域中的应用

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1、实时荧光定量PCR简介及其在食品检测领域中应用摘要：实时荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术；该技术不仅实现对DNA模板定量，且具有灵敏度高、特异性强、无污染性、及实时性和准确性等特点。该文主要介绍实时荧光定量PCR原理和在食品检测中应用，及其在食品领域发展前景。关键字：荧光定量PCR；致病菌检测；转基因食品检测Abstract：Real–timefluorogenicquantitativepolymeraseChainReactionisaquantitativenucleicacidstechnologyba

2、sedonquanlityPCR，withcharacteristicsofhighsensitivityandspecificity，pollution–free，instantaneityandaccuracyaswellasrealizationforquantitationofDNAtemplate.itsprincipleandapplicationinfooddetectionhavebeenintroducedinthisarticle，anditsprospectinfoodfieldpredicted.Keyword：r

3、eal–timequantitativePCR；pathogendetection；geneticallymodifiedfooddetection一、实时荧光定量PCR技术原理实时定量荧光PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量的体系。PCR反应过程产生DNA拷贝数，随反应循环数增加，以呈指数方式增加逐渐转入平台期。在传统PCR中，用终点法对PCR产物定量有不足之处；而在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，加入的荧光物质具有特定的波长，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光

4、信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选

5、择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT（thresholdvalue）值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横

6、坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[1~2]一、实时荧光定量PCR类型实时荧光定量PCR类型主要有探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交探针指示扩增产物增加，特异性高；而非探针类是即实时定量荧光PCR技术最后是通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。利用染料或特殊设计引物指示扩增增加，特异性受到质疑，但其简便易行。近年来，又发展一些新的预防或识别非特异扩增的探针法，例如Amplisensor技术、分子信标（Molecularbeacon）、L

7、ightcycler技术、复合探针法（Complexprobes）等。（1）实时荧光定量PCR类型探针类按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqManTM探针(水解探针)、TaqManMGB(水解探针)、Dual-oligoFRETpairs(双杂交探针)、MolecularBeacons(杂交探针)、ScorpionsTM/AmplifluorTM(杂交探针)、Universalprobelibrary-LNA(lockednucleicacids水解探针)、LUX(杂交探针

8、)、Simpleprobe探针等[3]，具体见图1。A.DNA结合染料B.杂交探针C.水解探针D.分子信标E.蝎状引物F.发卡式引物G.lightuponextention杂交探针图1.各种探