间充质干细胞成骨及成脂诱导培养基标准制作方法

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2、·更新：2013-07-0111:12间充质干细胞培养细胞诱导分化时必然用到的就是培养液，配置出合适的培养液能够促进细胞的分化，因此这一步操作时相当的关键。如何才能配置适合的诱导培养液呢？济南中赛生物来介绍成骨与成脂诱导培养液的配备方法。成骨诱导培养液配备与诱导操作：1.准备含10%FBS的α-MEM培养液；2.在备好的α-MEM培养液中添加50μM抗坏血酸,10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松；3.准备6孔培养板，将P4细胞按照5×103个/平方厘米的规格接种于原始α-MEM培养液中；4.待细胞长至基本融合后，更换上

3、述制备完成的成骨诱导培养液；5.每三天换液一次，细胞长至7天时进行碱性磷酸酶染色；6.二十八天后再进行矿化结节的茜素红染色。茜素红染色方法介绍：1.去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次；2.使用10%甲醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；3.按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；4.清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次；5.倾斜放置2min,吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。成脂诱导培养液配备与诱导操作：1.配置FBS10%含量的HG-DMEM培养液；2.在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1μ

4、M地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mMIBMX；3.准备6孔培养板，将P4细胞按照2×104个/平方厘米的规格接种于原始HG-DMEM培养液中4.待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。红油O染色方法介绍：1.去除细胞使用的当前培养液，使用PBS清洗两次；2.27.5%甲醛室温固定20分钟；3.重蒸馏水清洗3此，空气中干燥；4.加入0.5%的红油室温孵育一小时；5.配制70%乙醇溶液清洗3次；6.倒置显微镜观察拍照记录。丁香园二、诱导成骨

5、体系1．试剂  溶剂  终浓度  储存浓度  1ml体系加量Dex  去离子水  0.1μM  1mM  0.1μLVc  PBS  50μM  50mM  1μLβ-磷酸甘油  PBS  10mM  1M  10μL2．DMEM（HG）和10%FBS。3．3代以上细胞，，24孔板每孔105个细胞，六孔板每孔6000个细胞，每三天半量换液，共诱导2周。成骨诱导剂：地塞米松（1×10-8mol/L），β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50ng/ml，高糖DMEM，青链霉素各100u/ml，体积分数10%的胎牛血清。成骨诱导培养基成分：兔骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175m

6、L兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20mL谷氨酰胺2mL双抗2mL抗坏血酸400μLβ－甘油磷酸钠2mL地塞米松20μL成脂诱导培养基成分：兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基A液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基A175mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20mL谷氨酰胺2mL双抗2mL胰岛素400μLIBMX（IBMX,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）200μL罗格列酮（吲哚美辛）200μL地塞米松200μL兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液兔骨髓间质干细胞成脂诱导分化基础培养基B175mL兔骨髓间质干细胞培养专用胎牛血清20mL双抗2mL谷氨酰胺2mL胰岛素400μL对成脂肪

7、诱导要特别提醒你，用国产血清比进口的效果更好（仍为10%浓度）。我用的是SIGMA的地塞米松（D1756），25mg包装的，248元贵的惊人！！须用无水乙醇溶解。我也用过病房常用的5mg的地塞米松磷酸钠，效果也挺好的。首选的是dexamethasone-watersoluble，cellculturetested。至少可以配成1:1000的母液，使用起来很方便。使用医用制剂尤其要小心溶剂的问题，好些制剂不是融解在水里的，如果你没有设置合适的阴性对照，会给你的实验带来Bug。脂肪诱导培养液：DMEM,10％FCS，10-6M地塞米松，100微克／ml1一甲基一3一异丁基一黄嘌呤，50微

8、克／ml抗坏血酸。很难找到一套抗兔的抗体。油红染色的方法如下：脂肪油红染色（原位）：1.称取0.5g油红干粉，溶于100mL异丙醇中，配成0.5％油红储存液，棕色瓶保存。2.除去培养基用PBS洗涤1遍3.加10％中性甲醛固定5min4.稀释油红储存液，油红;去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10min（除去一些杂质，染色结果更清晰）5.染色30min，如果是培养皿或培养板，加的体积覆盖住板底即可。如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml。6.显微镜观察