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时间:2019-06-18
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1、13.051/BE.340第十三讲细胞行为的定量分析1.细胞培养a.为何采用细胞培养?体内(活体)体外(如玻璃,培养基)1.简化的模型系统1.天然的三维环境利2.可独立研究各个参数2.所有相关信号均存在3.观察过程是时间的函数1.多变量—噪音数据1.非天然的二维环境弊2.需考虑到动物权利等问题2.可能会缺少重要的信号b.细胞培养的类型原代培养原代培养:直接来源于活体☺对真实生物体的功能性反射/细胞会最终死亡/一些种类的细胞不易分化(神经细胞)时间细胞系:来源于原代细胞(非克隆)☺被更改的基因⇒可长期
2、存活z被隔离的自发性突变z肿瘤细胞z病毒性致癌基因的传染细胞系时间23.051/BE.3402.细胞功能的评价¾附着¾迁移¾繁殖¾分化(显型变化,如血液干细胞⇒白细胞)¾分泌(蛋白产物)a.细胞附着测试重要性:对于细胞的其它功能而言,细胞附着是必须的—它可提供生物物理和生物化学的刺激。¾沉降测试:1.在体外,细胞以给定的密度(面积)被种植在适宜表面一定时间。2.轻轻地冲洗表面,并保持细胞计数,如通过光学显微镜法或Coulter计数法(细胞分离,悬浮并测定流过狭窄通道的电阻变化达到“计数”目的)。粘附
3、率(%)处理过的表面TCPS(控制)3.为了测定细胞的阻抗,细胞种植在含有血清的培养基中比无蛋白溶液中更准确。提示:血浆与血清血浆—血液的液体部分(细胞被除去)血清—除去凝血剂的血浆(如:FGN)33.051/BE.340⇒沉淀测试不能给出粘附强度方面的数据¾细胞铺展测试1.细胞以给定密度种植在适宜表面一段时间2.测量投影表面积的增加(光学显微镜法)距水平仪较近,但仍不是对粘附性的直接测量铺展表示焦点接触的形成—代谢活动¾离心试验(正交力)1.细胞被种植在有盖24眼孔板中一段时间2.孔板放入离心机,
4、由于力的作用细胞粘附并可被检测出43.051/BE.340法向力(离心分离)剪切力(流动腔)剪切法向细胞残余量外加力便于对比采用公制¾流动小室测试:(剪切力)1.细胞种植在平行的平板小室内2.流体流动的速度梯度在细胞键合表面产生剪切力—通俗地讲像是“皱纹”53.051/BE.340b.细胞迁移测试重要性:z组织培养(胚胎)z免疫和炎性应答(白血球的趋化性)z脉管基因-内皮细胞迁移形成脉管系统z患处愈合—成纤维细胞迁移形成结缔组织z肿瘤转移细胞如何迁移?肌动蛋白结合在细胞骨架上⇒“薄层集落”扩张在肌动
5、蛋白微丝上产生收缩力通过焦点接触,力被传递给培养基⇒转录肌蛋白丝层聚集焦点接触短期:细胞有方向性运动长期:细胞运动类似于扩散过程(非化学梯度或物理屏障)63.051/BE.340量化途径:1.单个细胞的测量2.细胞群体的迁移¾单个细胞的测试延时电视显微镜跟踪表面细胞的运动(在流体或凝胶下方),该运动是时间变化的函数1.测量从起点pt.行径的距离(d),该距离是时间的函数(t)2.拟合数据模型得到化学反应速度(S)和持续时间(P)(细胞依赖性)P:最初方向的记忆时间(通常min-hrs)S:测量单位时
6、间内质心的位移(通常1-50µm/h)222–t/P自由行程模型:〈d(t)〉=nS[Pt–P(1-e)]维数(2)M式中d(t)2=1d(t)2M∑ii=1M=测量的数目提示:≡0,t>>P为什么?73.051/BE.340M=假如每次停顿被用作一个单独的数据点时的细胞数细胞1号路经细胞2号路经为了达到较好的统计结果需要测量较多的细胞路经(较为枯燥!!)间隔地,也可利用同一细胞的不同数据:策略(ⅰ):把在其轨迹上的每个点作为一个“起始点”(所有的样品点是等量的)策略(ⅱ):阻断进入N/
7、M的迁移路经(N=样品间隔△t的总和)83.051/BE.340拟合成随机行走模型222–t/P〈d(t)〉=nS[Pt–P(1-e)]对于短时间内t
P:d(t)=nSPt−nSP2〈d(t)〉对t作图:2〈d(t)〉(µm)时间(min)2斜率=nSP2Y-截距=-nSP⇒P和S的值93.051/BE.340比较在同一培养基上不同类型细持续时间(P)胞迁移的P和(min)S…速度如何与炎性响应的发生顺序相关?速度(S)(µm/min)摘
8、自D.A.Lauffenburger和J.J.Linderman,《受体:结合模型,传输与信号》,OxfordU.Press,199322对于t>>P:〈d(t)〉=nSPt1/221/2穿行距离~时间或〈d(t)〉=SnPt(扩散运动)类似于原子和分子的扩散系数(D),对于细胞,我们可以定义运动系数µ:22221/2µ=SP/n⇒〈d(t)〉=nµt或=4µt(两天)代表型值范围:-9-82µ~10-10cm/sec103.051/BE.340趋化性假如趋化性
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