聚合酶链反应及其应用

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1、52341678PCR的原理与反应条件PCR的DNA聚合酶与扩增的精确性PCR的模板及制备PCR的引物设计及合成PCR反应的其它控制参数PCR技术的衍生与发展PCR技术在生命科学研究中的应用PCR技术在临床医学方面的应用聚合酶链反应及其应用PCR技术的诞生与发展1PCR的原理与反应条件PCR技术的反应条件PCR技术的基本原理PCR反应的质量指标PCR技术的诞生与发展聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）又称为PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。1985年，美国PE-ce

2、tus公司人类遗传研究室的Karymullis发明了具有划时代意义的PCR技术；1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；1993年，Karymullis因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖；1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。PCR技术的基本原理5‘5‘待扩增DNA区域5‘变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合1235

3、‘5‘5‘PCR技术的反应条件DNA或RNA模板5‘5‘待扩增DNA区域5‘94℃5min5‘5‘55℃退火5‘5‘聚合5‘5‘5‘5‘5‘循环25-30次目标DNA片段达106-107变性70℃DNA引物DNA聚合酶dNTPsMg2+（缓冲液）PCR反应的质量指标PCR反应的质量标准有：特异性（序列选择）有效性（序列产量）上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCR反应中必须准确性（序列对错）对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCR反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。P

4、CR扩增反应的精确性2PCR的DNA聚合酶与扩增的精确性用于PCR的DNA聚合酶简介DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响DNA聚合酶的使用PCR扩增反应的精确性利用PCR技术扩增DNA靶序列的一个重要问题是这种DNA体外聚合反应的序列忠实程度，即DNA扩增产物序列的准确率。PCR反应的准确率远远低于细胞内的DNA聚合反应，除了缺少完善的DNA聚合校正系统外，影响PCR反应准确率的因素还包括：DNA聚合酶的保真性能（主要因素）DNA链的物理损伤PCR反应体系的洁净度DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响DNA聚合酶的保真性主要取决

5、于其3’→5’的核酸外切酶活性，它负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的出错率在每轮延伸每核苷酸1.6X10–6-2.1X10–4范围内。DNA聚合酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：与dNTP的结合特异性磷酸二酯键的形成速率焦磷酸的释放速率碱基错误掺入之后的持续延伸性3’→5’的核酸外切活性的强弱用于PCR的DNA聚合酶简介TaqDNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），因为它没有3’→5’的的核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使Taq酶的聚合出错率降低到原来的1/3。

6、TaqDNA聚合酶催化的聚合反应的普遍则TaqDNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus）错误类型是由AT转换为GC；如果模板DNA具有形成二级结构的可能性避免稀释保存TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性TaqDNA酶在使用时应注意：用于PCR的DNA聚合酶简介KlenTaqDNA聚合酶是一种N端缺失了的TaqDNA聚合酶，因而没有5’的核酸外切酶活性；KlenTaqDNA聚合酶的Mg2+最佳浓度范围很宽，因此很容易优化KlenTaqDNA聚合酶（Th

7、ermusaquaticus）在最佳反应条件下，KlenTaqDNA聚合酶出错率为5.1X10–5，性能略优于TaqDNA聚合酶。反应条件；用于PCR的DNA聚合酶简介TthDNA聚合酶在Mn2+的存在下，能有效地反转录长度在1000碱基以下的RNA；TthDNA聚合酶在Mg2+的存在下，能由DNA模板合成DNA；TthDNA聚合酶（Thermusthermophilus）好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题。TthDNA聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很用于PCR的DNA聚合酶简介Pfu是一种高保真的DNA

8、聚合酶，出错率极低；PfuDNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端；PfuDNA聚合酶扩增速度极快，达1.5-2min/kb；PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus）PfuDNA聚合酶的热稳定性很高。7.0X10–7-1.6X10–6用于PCR的DNA聚合酶简介