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《重组猪_干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、18卷3期生物工程学报Vol.18No.32002年5月ChineseJournalofBiotechnologyMay2002重组猪α干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达12,32,32,331陈涛于瑞嵩刘惠莉李震曹祥荣1(南京师范大学生命科学学院,南京210097)2(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)3(上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)摘要用巨引物PCR法介导的定点突变把猪α干扰素(PoIFN2α)第86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC),同时将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC,
2、构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX2IFN,表达产物占菌体总蛋白的20%。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理,并以FPLC进一步纯化,得到了具有较高生物活性的产物(5200IUPmg)。关键词猪α干扰素,巨引物PCR,定点突变,包涵体中图分类号Q78文献标识码A文章编号100023061(2002)0320339204干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快生物制品研究所,Sephecyic200购自Phamacia公司,的第一抵御病毒体系。人和鼠的干扰素已得到深入其它试剂均为国产分析纯。研究,但对于猪的干扰素研究相对较少。我国是养人羊膜上皮细胞
3、(WISH)及水疱性口炎病毒猪大国,而猪的病毒性疾病种类多、危害大,发展具(VSV)购自卫生部上海生物制品研究所。广谱抗病毒效应的猪干扰素无疑有重要意义。112方法[4]猪α型干扰素(PoIFN2α)基因无内含子,蛋白糖11211定点突变:采用巨引物PCR法。根据所得[1][2]基化修饰也不重要,因而方便利用原核表达载体PoIFN2α序列设计3条引物:表达。我们在研究中克隆到编码猪α型干扰素成熟P1:5′GATCCTGCGACCTGCCTCA3′;[2]肽部分的基因片段并在大肠杆菌中进行了表达,P2:5′GCTGATCCAGTCCAGTGTAGAAC3′;发
4、现其活性较低,估计其编码肽段的第86位Cys可P3:5′CAGAATTCAGAATGGGCTTG3′。[3]能影响了干扰素的抗病毒活性。本实验参照其中P1处于IFN基因的5′端,斜体C为引入[1]PoIFN2α1序列将此位点突变为Tyr,然后用大肠杆的突变碱基,并在前面加了GATCC(下划线部分),菌融合表达系统表达出GST2IFN融合蛋白,目的产以便与经BamHI酶切后用S1核酸酶削平的载体进物纯化后具有较高的抗病毒活性。行平端连接构成新的BamHI酶切位点。P2处于IFN基因内部,斜体T为引入的突变碱基。P3处于1材料与方法IFN基因的3′末端,下划线部
5、分为引入的EcoRI酶111材料切位点(引物示意参见图1)。菌种和质粒:受体菌E.coliDH5α、E.coliBL21为本室保藏菌种;pGEX24T23载体购自Pharmacia公司;pUCm2IFN质粒为本室构建、保存。工具酶和试剂:PfuDNA聚合酶购自上海生工图1引物示意图Fig.1Positionofprimers生物工程公司,限制酶、T4DNA连接酶、S1核酸酶Theasterisk(3)indicatesthesitestobemutated购自TaKaRa公司,HuIFN2α标准品购自卫生部上海收稿日期:2001212217,修回日期:200
6、2202228。基金项目:上海市农科院重点学科青年科技骨干培养基金。3通讯作者。Tel:86221262200389;Fax:86221262207858;E2mail:zhenli60@public31sta.net.cn340生物工程学报18卷以P1、P2为引物,pUCm2IFN质粒为模板,用Pfu浓度1mgPmL,诱导3h后离心收集菌体。聚合酶进行扩增,条件为95℃预变性3min,95℃30s,11214表达产物纯化:62℃退火及延伸50s,25个循环,产物用低熔点琼脂糖(1)细胞破碎及包涵体洗涤:以超声波破碎诱法割胶回收,记为U。再以U、P3作引物,
7、pUCm2IFN导后菌体,离心后沉淀用适量包涵体洗涤液质粒为模板,用Pfu聚合酶进行扩增,扩增条件:95℃(20mmolPLTrisPHCl,pH810,5mmolPLEDTA,0102%预变性3min,95℃30s,62℃退火及延伸80s,30个循溶菌酶,75μgPmLPMSF,75μgPmL苯甲酰胺)重悬,室环,所得产物即为突变后IFN。暂记作rPoIFN2α1。温下置于磁力搅拌器上搅拌1h。加0125体积10%11212表达质粒的构建:构建过程参见图2。用(WPV)脱氧胆酸钠,使其终浓度为2%(WPV),继续1%低熔点琼脂糖凝胶分离回收Pfu聚合酶扩增
8、的搅拌1h。室温17000g离心20min。沉淀以2
