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1、化学与生物工程2009,Vol.26No.5开发应用55Chemistry&BioengineeringPCR2DGGE在水处理微生物群落多样性分析中的应用卢永,陈秉娟,申世峰,严莲荷,周申范,张建法(南京理工大学化工学院,江苏南京210094)摘要:阐述了PCR2DGGE技术的原理及其操作过程中的常见问题,并提出了相应的解决方法。综述了PCR2DGGE技术在水处理微生物群落多样性和动态性研究中的应用现状、局限性,展望了该技术的发展方向。关键词:PCR2DGGE;水处理微生物;微生物群落;多样性分析中图分类号:Q939文献标识码:A文章编号:16
2、72-5425(2009)05-0055-05生物处理方法已经成为最重要的水处理方法之的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,电泳迁移率的差异一。生物处理系统中微生物群落的种群结构分析和动会使不同序列的DNA片段停留在凝胶的不同位置,态性分析对研究生物降解过程和污染物转化途径具有形成相互分开的条带。只要选择的变性剂梯度、电泳重要意义,同时还能为优化处理工艺条件和提高处理时间、温度等电泳条件足够精细,理论上可分开仅有一效率提供可靠的理论依据。传统的微生物群落种群结个碱基差异的DNA片段。构分析方法主要有显微镜观察和分离培养、依据形态PCR2DGGE研究微生物
3、群落的步骤如图1所示。结构特征和生理生化特性进行分类鉴定等。但这些方法步骤繁琐、工作量大,难以模拟微生物生长繁殖的真实条件,不足以反映微生物环境中的真实情况,而且对于生理生化特性相似的菌株难以正确区别和鉴定,存[1,2]在很大的局限性。[3]1993年,Muyzer等首次将PCR2DGGE(Poly2merasechainreaction2denaturinggradientgelelectro2phoresis)技术应用于微生物生态的研究,这一指纹分析技术的出现克服了传统培养技术的局限性。由于PCR2DGGE具有可靠、方便快捷、重现性好等优点,
4、迅图1PCR2DGGE研究微生物群落的步骤速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具。Fig.1Theanalysisprocessformicrobial作者在此阐述了PCR2DGGE技术的原理和操作过程communitybyPCR2DGGE中的常见问题,及其在水处理微生物群落多样性和动态性研究领域的应用现状、局限性和前景。2PCR2DGGE的操作过程1PCR2DGGE的基本原理211样品的预处理与DNA提取PCR2DGGE技术建立在总遗传信息分析的基础PCR2DGGE技术是基于核酸序列的不同,将片段上,DNA提取质量的好坏直接影响着后续实验
5、。然而大小相同的DNA序列分开。在进行变性梯度凝胶电对于复杂样品,DNA提取通常需要经过样品预处理、泳时,不同序列的双链DNA分子4种碱基的组成和细胞裂解、DNA沉淀等步骤,这些操作易造成菌种数排列有差异,双链的解链需要不同的变性剂浓度,并会[4]量和DNA含量的变化,引起分析偏差。发生空间构型的变化,最终导致电泳迁移率的差异。微生物样品总DNA提取方法包括间接法和直接当双链DNA分子在含梯度变性剂(如尿素、甲酰胺)收稿日期:2008-12-25作者简介:卢永(1983-),男,安徽泗县人,博士研究生,研究方向:生物化工;通讯联系人:严莲荷,研究
6、员。E2mail:luynjust@ya2hoo.com.cn。56卢永等:PCR2DGGE在水处理微生物群落多样性分析中的应用/2009年第5期[5,6]法。间接法是先经过梯度离心和离心洗涤等去除DNA聚合酶的质量和保真性对扩增产物影响较[15]样品中的杂质,然后收集细胞和裂解细胞,该法易造成大。罗海峰等利用DGGE比较了TaqDNA聚合微生物种类和数量的丢失;而直接法是直接对样品处酶、TsgDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶对PCR扩增理使细胞裂解,该法会造成样品中杂质对DNA的污产物的忠实性,结果发现PfuDNA聚合酶的扩增效果染。最好。为使
7、提取的DNA分子具有代表性,必须保证所[16]为了减少基因拷贝数的影响,Rantsiou等和有微生物细胞无选择性地裂解而释放出核酸物质。目Renouf等[17]选用单拷贝的RNA聚合酶亚单位基因前裂解水处理微生物样品细胞的方法有:酶法、化学法rpoB作为靶基因,对食品发酵中乳酸菌的菌群组成和和机械法,以及三种方法的有机结合。微珠振荡法是菌群的适时变化进行分析,避免了基因拷贝数的影响。[7]一种方便且有效的细胞裂解方法,能彻底破坏样品[18]此外,PCR扩增时,模板浓度和模板被污染的结构,而且对细胞无选择性。[19]程度也会导致PCR扩增结果的差异
8、。DNA提取过程中一般用乙醇、异丙醇和聚乙二醇213DGGE电泳等有机溶剂沉淀DNA分子,这些有机溶剂对样品的理论上,通过选择DGGE电
