热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞凋亡

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1、210陕西医学杂志2003年3月第32卷第3期热盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞凋亡及其调控基因蛋白表达影响的实验研究西安市中心医院消化科(西安710003)张玲霞　张　沥　徐俊荣　贾长河　张宁霞　曹广周　　摘　要　目的:研究热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织中的凋亡细胞及其调控基因Bcl22、Fas表达状态,以探讨长期热咸饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系。方法:采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口末端标记(TUNEL)技术及免疫组织化学染色技术。细胞凋亡时DNA含量分析采用流式细胞检测技术。结果:TUNEL检测细胞凋亡显示,在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎中凋亡细胞数明显增多,

2、在粘膜全层均可见到,呈弥漫性分布。萎缩性胃炎中凋亡细胞指数显著高于正常大鼠胃粘膜;免疫组化法检测凋亡相关基因显示,Bcl22、Fas在热盐水灌胃所致的萎缩性胃炎中的表达率显著高于正常胃粘膜;热盐水灌胃不同时间大鼠胃粘膜中Bcl22、Fas蛋白表达率随灌胃时间延长而逐渐增加,在4周、8周、12周时Bcl22蛋白表达率分别为12.5%、16.7%、76.5%,Fas蛋白表达率分别为18.75%、22.2%、64.7%;流式细胞检测显示,在萎缩性胃炎时,在G0öG1峰前可见一个亚G0öG1峰,也即凋亡细胞峰出现,而在正常胃粘膜时未显示亚G0öG1峰。结论:热盐水灌胃可导致大鼠胃粘膜组

3、织细胞凋亡异常,其调控基因(Bcl22、Fas)在热盐水所致的大鼠萎缩性胃炎发生中起重要作用。　　主题词　胃炎,萎缩性ö病理学　氯化钠类ö副作用　@细胞凋亡　基因,调节　大鼠　　本研究采用脱氧核糖核酸转移酶介导等缺口2.1　大鼠萎缩性胃炎模型的制作:采用末端标记(TUNEL)技术、流式细胞检测技术及55℃、15%的盐水连续灌胃12周,制成大鼠萎缩免疫组织化学染色技术对热盐水灌胃导致的大鼠性胃炎模型,在灌胃期间每隔4周处死一批大鼠。萎缩性胃炎胃粘膜上皮组织中的凋亡细胞及其调对照组采用等量的蒸馏水灌胃12周。具体造模方[1]控基因(Bcl22、Fas)表达状态进行观察,以探讨它法见

4、参考文献。收集制模阶段的大鼠胃粘膜石们在热盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎发生中所蜡包埋标本68例(其中萎缩性胃炎标本34例)及起的作用,探讨食物的温度及咸度造成胃粘膜萎对照组大鼠胃粘膜石蜡包埋标本32例进行检测。缩的原因,为预防胃癌前病变和胃癌的发生提供2.2　细胞凋亡的检测:采用末端转移酶介导实验依据。的dUTP切口末端标记法(TUNEL)。染色步骤:材料与方法①4Lm石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化;1　材　料　100只7周龄健康、性成熟的雄②新鲜配制3%H2O2及90%甲醇混合液封闭,室性SD大鼠,体重200～250g,由第四军医大学动温处理10min阻断内源酶;③加TB

5、S1:100稀释物实验中心提供;细胞凋亡试剂盒(InSituCellProteinaseK37℃消化15min;④加标记缓冲液ApoptosisDetctionKitI,POD),SABC、即用型(LabelingBuffer)20Llö片,以保持切片湿润,4℃试剂盒、Bcl22、Fas一抗、生物素化的二抗均购自过夜20h,取出再置37℃标记2h;⑤加封闭液武汉博士德生物技术公司;流式细胞检测采用50Llö片,室温30min;⑥用封闭液1∶100稀释生USA2Coulter公司流式细胞仪(ELITE型)。物素化抗地高辛抗体,50Llö片,37℃反应30min;2　方　法⑦用TA

6、B1∶100稀释SABC,混匀后加至切片,陕西医学杂志2003年3月第32卷第3期21137℃反应30min;2～3步后蒸馏水洗涤3次,每次表1　大鼠正常胃粘膜、萎缩性胃炎中2min;6～7步后TBS洗涤3次,每次2min;⑧Bcl22、Fas蛋白表达率DAB2H2O2显色10min,苏木素轻度复染,脱水透Bcl22蛋白表达Fas蛋白表达率明,封片。病理检查n阳性例数%阳性例数%2.3　免疫组织化学染色:采用SABC即用正常胃粘膜32412.5618.7型试剂盒,切片常规脱蜡水化,经3%过氧化氢23萎缩性胃炎342676.52264.790%甲醇封闭内源性过氧化物酶20min,

7、微波修复抗原10min,山羊血清孵育25min后加一抗　　注:3与正常胃粘膜比较,P<0.01(P53、ras),4℃冰箱过夜,次日加对应的生物素化2　免疫组化法检测凋亡相关基因　Bcl22、二抗,37℃,30min;ABC复合物,37℃,30min。之Fas阳性反应物呈棕黄色,主要位于胞浆中,个别后用DAB显色。以上各步骤除血清孵育后甩干病例在胞核中也有表达,见图2、3。Bcl22、Fas在血清直接加一抗外,均间以PBS洗涤3次,每次3热盐水致大鼠萎缩性胃炎中的表达率显著高于正～5min。