TA载体pEASY_T1Simple在基因克隆中的新应用_杨文丽

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1、第18卷第2期天津农学院学报Vol．18，No．22011年6月JournalofTianjinAgriculturalUniversityJune，2011文章编号:1008－5394(2011)02－0013－03TA载体pEASY－T1Simple在基因克隆中的新应用通信作者杨文丽，丁博，王俊斌，李明，吕芳芳，谢晓东(天津农学院农学系，天津－布里斯托环境变化对农作物影响研究中心，天津300384)摘要:在基因克隆操作中，由于常用克隆载体多克隆位点的酶切位点数目有限，造成一些DNA片段的克隆、连接受限。为解决这一问题，本文利用pEASY－T1Simple载体无酶切位点的特点，通

2、过TA克隆的方法引入多个单一酶切位点，并对所构建的克隆载体进行了验证。最后证明，这种方法可高效构建含有不同多克隆位点的载体，克服了对常用克隆载体的依赖，大大提高了基因操作的灵活性和有效性。关键词:TA克隆;pEASY－T1Simple;多克隆位点中图分类号:Q782文献标识码:ANewApplicationofTAVectorpEASY－T1SimpleinGeneCloningCorrespondingAuthorYANGWen－li，DINGBo，WANGJun－bin，LIMing，LFang－fang，XIEXiao－dong(Tianjin－BristolResearc

3、hCenterfortheEffectsoftheEnvironmentChangeonCrops，DepartmentofAgronomy，TianjinAgriculturalUniversity，Tianjin300384，China)Abstract:AmajorchallengeinthecloningofmultipleDNAfragmentsistofindsuitablerestrictionenzymesitesinthecommonlyusedcloningvectors．Toaddressthisproblem，inthisstudy，itisconstruc

4、tedanewTAcloningvectorsbyaddingdesirablemultiplecloningsites(MCS)tothepEASY－T1Simple，whichdonotcontainanyrestrictionenzymesitesinoriginalforms．Subsequently，itisverifiedthenewcloningvectorsbydigestingthedesignedMCS．TheresultsshowthatthedesignedMCSweresuccessfullyengi-neeredintothepEASY－T1Simple

5、vector．Insummary，anefficientmethodhasbeendevelopedtoconstructthepersonalizedTAcloningvectorswithdesirableMCSs，andthustoimprovetheflexibilityandefficiencyofgeneengineering．Keywords:TAcloning;pEASY－T1simple;multiplecloningsites在基因克隆操作中，常常依据研究目的的不广泛。同，将多个DNA片段连接到克隆载体的多克隆TA克隆法是在DNA片段的3'端加上A，与位点，从而

6、合成一个新的重组DNA。常用的克隆经过特殊处理的具有3'－T突出末端的DNA片段载体有pBluescript、pBR322和pUC等，这些载通过T/A配对进行连接。采用这种方法克隆时，体含有不同的多克隆位点，适于将含有不同酶切无需引入限制性酶切位点，不需要对DNA片段［1］位点的DNA片段连接起来。但研究中发现，进行修饰，如酶切、平末端化或去磷酸化处理［2］有些DNA片段在常用的克隆载体上找不到合适等，具有操作简单、快速、重组效率高等优［3］的限制性酶切位点，因此不能把这些DNA片段点。目前所使用的TA克隆载体主要有pLUG－连接到载体上进行基因工程操作。为解决DNAT、pGEM－

7、T、pED－T、pEC－T、pSC－T、［4］克隆受酶切位点所限的问题，一些不依赖于限制pEASY－T1Simple、pEASY－T等。但TA克性内切酶的克隆方法被开发出来，例如TA克隆隆法只能对单一DNA片段进行克隆，不能进行和TOPO克隆等方法，其中TA克隆应用得较为多个DNA片段的克隆和连接。收稿日期:2011－02－25基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项“小麦抗旱耐高温相关转录因子和miRNA基因的克隆及重要候选基因的功能鉴定”(2009ZX08009