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《佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞的体外培养与鉴定_毛伟》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、动物医学进展,2011,32(3):78-82ProgressinVeterinaryMedicine*佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞的体外培养与鉴定*毛伟,李培锋,刘明强,关红(内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特010018)摘要:探讨佐剂性关节炎(AA)大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)的体外培养及鉴定方法,制备AA大鼠模型,采用组织块培养法培养AA大鼠FLS,并通过形态学、透射电镜及RT-PCR方法对FLS进行鉴定。结果表明,培养的滑膜细胞具有成纤维细胞的形态和特征,呈长梭形极向生长,RT-PCR方法检测波形蛋白表达较高。
2、本研究成功地培养出了AA大鼠滑膜细胞,可作为进一步研究的靶细胞。关键词:佐剂性关节炎;成纤维样滑膜细胞;体外培养中图分类号:S852.34文献标识码:A文章编号:1007-5038(2011)03-0078-05类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是产品;其他试剂均为国产或进口分析纯。以慢性多关节炎症为主要表现的全身性自身免疫疾1.2方法病,病因和发病机制尚未完全清楚。在RA中,滑膜1.2.1AA模型的复制将12只大鼠随机分为的持续性增生和软骨及骨的破坏是其重要的病理学AA模型组和正常对照组,每组6只。按
3、照文献[6][1]特征。佐剂性关节炎(Adjuvantarthritis,AA)大将BCG80e灭活1h后,与高压灭菌的液体石蜡配鼠模型是研究RA及评价防治RA药物的常用动物成10mg/mL的完全弗氏佐剂(FCA),充分碾磨、混[2]模型之一,其病理表现与RA有一定的相似之处,匀,于模型组每只鼠左后足趾皮内注射0.1mL致[3-4]研究表明,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesy-炎。noviocytes,FLS)是RA病理改变的最终靶细胞,其1.2.2影像学观察免疫42d,对照组与模型组随过度增殖导致滑膜增生是RA
4、主要病理特征之机选取3只大鼠,30g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉[5]一,抑制FLS增殖,进而降低滑膜增生可成为治(1mL/kg),并将其仰位固定于X射线操作台上,进疗RA的有效策略。因此,制备RA动物模型以及行X光片照射,观察和比较各组大鼠足、关节及尾体外培养FLS可以为研究RA的病理机制及抗RA处的组织形态的改变。的药物开发提供一个理想的平台。大鼠佐剂性关节1.2.3滑膜细胞的分离、培养与传代按照文献炎是人类RA的动物模型之一,体外培养AA大鼠[6-7]的方法,造模后28d急性处死大鼠,置滑膜细胞,从分子细胞水平深入研究类风湿性
5、关节750mL/L酒精中浸泡15min,于膝关节正中纵行切炎的发病机制及在此模型上进行各种治疗性试验,开皮肤,分离肌肉,露出膝盖骨,继续向下分离,可见对进一步揭示RA的发病机制和抗类风湿药的作用平滑光亮的滑膜组织,取滑膜组织,去除脂肪、纤维机制,寻找有效的RA防治措施具有重要意义。等,用D-Hankcs液反复洗3次后剪成1mm3~1材料与方法32mm小块,以含200mL/L胎牛血清的DMEM培1.1材料养液充分漂洗至洗液清透后,吸取数小块均匀排列1.1.1实验动物SPF级Wistar大鼠,体重150g在培养瓶的底壁上,轻轻翻转培养
6、瓶,使瓶底朝上,?20g,均为雄性,由军事医学科学院实验动物研究置体积分数为5%的CO2培养箱中37e培养2h,中心提供(动物合格证号SCXK-(军)2007-004)。使其贴壁。再加入预温的含200mL/L胎牛血清的1.1.2药品与试剂医用卡介苗(BCG),卫生部上DMEM培养液,使液体刚覆盖组织块为宜,继续培海生物制品研究所产品;RNAisoTMPlus、反转录试养,每隔2d~3d换1次培养液,待有大量成纤维样剂盒及所用工具酶均为宝生物工程(大连)有限公司细胞长出组织块后去除组织块,继续培养。*收稿日期:2010-11-15基
7、金项目:国家自然科学基金项目(C30860210)作者简介:毛伟(1982-),男,山西五台人,博士研究生,主要从事兽医药理学与毒理学研究。*通讯作者毛伟等:佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞的体外培养与鉴定79当原代培养的滑膜细胞连续成片时可进行传1.2.4.4总RNA的提取弃掉培养液,用PBS液代,弃去培养液,用D-Hank.s液洗涤细胞2次,弃洗涤2次,按RNAisoTMPlus说明书提取FLS总去D-Hank.s溶液,加入2.5g/L的胰酶消化3minRNA。~5min,倒置显微镜下观察,当细胞缩成胖梭形、折取适量RNA溶液
8、,用紫外分光光度计检测,通光度降低时,倒去胰酶,加入上述培养液终止消化,过波长在260nm和280nm的吸光度值(OD260/用吸管轻轻吹打细胞,制成单细胞悬液,以1B3比OD280)的比值判断RNA纯度,通过琼脂糖凝胶电泳例进行传代。传代细胞呈单
