小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

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1、小鼠胚胎干细胞饲养层的制备作者：胡一新,黄王景单位：1.贵州省贵阳市第二人民医院，贵州贵阳5500032.贵阳医学院附属医院儿科，贵州贵阳550003【摘要】目的探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中，含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞，观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行，胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长，且保持未分化状态。【关键词】胚胎成纤维细胞;小鼠;胚胎干细胞Preparationoffeedercellsofmouseembryo

2、nicstemcellHUYi-xin1,HUANGJing2（1.TheSecondPeople′sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550003,China；2.TheAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550003,China）Abstract：ObjectiveToinvestigatethepreparationmethodsoffeedercellsofmouseembryonicstemcell.MethodMouseembryonicstemcellwereobserv

3、edintwoculturesystems：onfeedercellsoftheprimarymouseembryofibroblastsandinleukemiainhibititoryfactoronfree-feedercells.ResultsTheprimarymouseembryofibroblastswereobservedradiallyorcircinately.TheEScellscloneappearedtypically.ConclusionTheEScellscangrowwellandmaintaininthestateofundifferentiati

4、onundertheconditions.KeyWords:Embryofibroblasts；Mouse；Embryonicstemcell胚胎干细胞（embryonicstemcell，EScell）是具有自我更新和多向分化能力的一类增殖旺盛的细胞，具有向机体各种组织细胞分化的潜能。体外培养中，为保持ES细胞的不分化，往往需将其接种于一定的饲养层上或加入白血病抑制因子。目前常用的饲养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryofibroblasts，MEF）、STO细胞等。由于STO细胞价格昂贵，不易获得，故本试验选择MEF为饲养层细胞，探讨胚胎干细胞饲养层的制备方法，为

5、胚胎干细胞的体外培养打下基础。1资料与方法1.1主要试剂及仪器：低糖DMEM培养基、非必须氨基酸(购自Gibco公司)；小牛血清(购自杭州四季青公司)；0.25%胰酶、胎牛血清(购自Hyclone公司)；重组小鼠白血病抑制因子（rmLIF）(Chemicon公司产品)。1.2细胞株：小鼠胚胎干细胞E14细胞株由中山大学干细胞中心提供。1.3主要溶液的配制：小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryofibroblasts，MEF）培养液：低糖DMEM+10%小牛血清。ES细胞培养液：高糖DMEM+15%胎牛血清，在无饲养层时另加入rmLIF10ng/ml。丝裂霉素：浓度为10μ

6、g/ml，以培养液新鲜配制。1.4方法1.4.1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养：①取12～14d的妊娠小鼠，颈椎法处死后，用75％酒精浸泡5min。②无菌条件下剖腹，暴露子宫，取出胎鼠，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤以去除血迹。③去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，PBS液洗净，用灭菌的眼科小剪刀把组织块剪至1mm3大小,向组织块加入适量的胰蛋白酶－EDTA消化液，37℃下消化2min。④加等体积含血清的培养基终止消化，静置，将组织块沉降后，将培养基吸至无菌试管中。⑤无菌试管离心（1000r/min）5min，弃上清，沉渣用含10%小牛血清的低糖DMEM培养液悬浮后接种至25cm2

7、一次性培养瓶，置于37℃、5％CO2、100%湿度的培养箱中培养。⑥培养开始2d不要晃动培养瓶，第3天换液，并去掉组织块和死细胞。每1～2d换液1次，如细胞已铺满，按1∶2～1∶3传代，传3～5代的细胞可做为饲养层使用。1.4.2饲养层的制备：①取1瓶快长满的胚胎成纤维细胞，吸掉原培养基，用PBS洗3次，加入含10μg/ml丝裂霉素C和10％小牛血清的低糖DMEM培养基，将培养瓶放回培养箱1.5～2h。②弃去含丝裂霉素C的培养基，用PBS洗5次以去除残余的丝裂霉